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May 18, 2023

Synthèse vs récupération d'ester

Volume Biologie des communications

Communications Biology volume 6, Article number: 306 (2023) Citer cet article

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Toxoplasma gondii est un agent pathogène zoonotique répandu qui infecte le bétail ainsi que les humains. La capacité exceptionnelle de ce parasite à se reproduire dans plusieurs types de cellules hôtes nucléées nécessite une utilisation coordonnée des ressources nutritionnelles endogènes et dérivées de l'hôte pour la biogenèse membranaire. La phosphatidyléthanolamine est le deuxième glycérophospholipide le plus courant chez T. gondii, mais la manière dont ses besoins au stade tachyzoïte à division rapide et à infection aiguë sont satisfaits reste énigmatique. Ce travail révèle que le parasite déploie des voies de synthèse et de récupération de novo pour répondre à sa demande de PtdEtn lié à l'ester et à l'éther. L'épuisement médié par l'auxine de la phosphoéthanolamine cytidylyltransférase (ECT) a provoqué un phénotype mortel chez les tachyzoïtes en raison d'une invasion et d'une division cellulaire altérées, révélant un rôle vital de la voie CDP-éthanolamine au cours du cycle lytique. En accord, le complexe de la membrane interne est apparu perturbé en même temps qu'une diminution de sa longueur, de sa largeur parasitaire et des principaux phospholipides. La lipidomique intégrée et les analyses isotopiques du mutant TgECT ont dévoilé la synthèse endogène d'ester-PtdEtn et la récupération des lipides liés à l'éther des cellules hôtes. En bref, cette étude démontre comment T. gondii exploite divers moyens pour produire des formes distinctes de PtdEtn tout en présentant la pertinence thérapeutique de sa synthèse de novo.

Le phylum de protozoaires Apicomplexa comprend de nombreux agents pathogènes intracellulaires courants, tels que Toxoplasma, Plasmodium, Eimeria et Cryptosporidium. Toxoplasma gondii - la seule espèce connue du genre - a une capacité remarquable à infecter de nombreux types de cellules nucléées chez divers vertébrés ; il est donc reconnu comme l'un des agents pathogènes les plus performants. L'infection naturelle des hôtes par T. gondii commence par l'ingestion des oocystes ou des kystes contenus dans les aliments contaminés. Les stades sporozoïte et bradyzoïte libérés de l'oocyste ou du kyste, respectivement, infectent l'épithélium gastrique et se développent ensuite en un stade tachyzoïte hautement infectieux, promiscueux et à division rapide, qui se reproduit dans d'autres tissus, provoquant éventuellement une nécrose par des cycles lytiques perpétuels1,2. Lors d'un stress physicochimique et immunitaire, certains tachyzoïtes se différencient en bradyzoïtes enkystés, établissant une infection chronique. Pour la reproduction intracellulaire au sein des cellules hôtes, le parasite doit produire une biomasse membranaire suffisante via ses voies de synthèse et de récupération, dont beaucoup confèrent d'excellentes cibles thérapeutiques antiparasitaires3,4.

Les glycérophospholipides constituent un ingrédient majeur des biomembranes des tachyzoïtes de T. gondii4,5,6,7,8. La phosphatidylcholine (PtdCho), la phosphatidyléthanolamine (PtdEtn), la phosphatidylthréonine (PtdThr), la phosphatidylsérine (PtdSer), le phosphatidylinositol (PtdIns), le phosphatidylglycérol (PtdGro) et le phosphatidate (PtdOH) sont des phospholipides typiques présents dans les tachyzoïtes et nécessaires au cycle lytique optimal. 5,7, 9,10,11,12. Outre leurs rôles habituels dans la réplication des parasites, de nombreux phospholipides sont récemment apparus comme des acteurs clés de l'homéostasie du calcium et de la transduction du signal, contribuant à la motilité glissante, à l'invasion et à la sortie des tachyzoïtes7,12,13,14,15. Le parasite est capable de synthétiser des phospholipides en utilisant des précurseurs acquis à partir de la cellule hôte5,7,9,10,11,12,16,17,18,19. En outre, il peut récupérer certaines espèces/sondes phospholipidiques du milieu extracellulaire et/ou intracellulaire12,18,20.

Le PtdEtn est le deuxième phospholipide le plus courant dans les tachyzoïtes, présent sous des formes liées à l'ester et à l'éther5,6,7. Plusieurs voies peuvent produire de l'ester-PtdEtn, y compris des décarboxylases PtdSer distinctes (PSD) situées dans la mitochondrie du parasite et la vacuole parasitophore, la voie CDP-éthanolamine alias Kennedy dans le réticulum endoplasmique et via le retournement médié par la P4-ATPase dans la membrane plasmique5,10, 20,21. Sa synthèse endogène par la voie CDP-éthanolamine nécessite un échafaudage de diacylglycérol qui peut être généré par les tachyzoïtes18. Bien qu'il n'ait pas encore été étudié chez T. gondii, le PtdEtn lié à l'éther contient un squelette alkyl-glycérol fabriqué par une alkyl-glycérone phosphate synthase dans les cellules de mammifères22. En termes fonctionnels, la forme conique de l'ester-PtdEtn contribue à la courbure de la membrane, régulant les événements de bourgeonnement, de fusion et de fission et facilitant ainsi les interactions membrane-protéine23. D'autre part, la forme de l'éther-PtdEtn permet une liaison hydrogène intermoléculaire plus forte entre les groupes de tête, entraînant une diminution de la fluidité de la membrane22,24.

Ce travail a examiné la biogenèse et la pertinence physiologique de l'ester et de l'éther-PtdEtn au cours du cycle lytique des tachyzoïtes de Toxoplasma. Nous avons étudié la phosphoéthanolamine cytidylyltransférase (ECT), qui catalyse la phosphoéthanolamine dérivée de l'éthanolamine kinase en CDP-éthanolamine dans le cytosol du parasite. Nos données montrent que l'ECT ​​est essentielle à la reproduction asexuée des tachyzoïtes dans les cellules humaines. Son épuisement conditionnel par mutagenèse altère la quantité et la synthèse des espèces ester-PtdEtn, tandis que l'éther-PtdEtn reste inchangé. De même, nous avons découvert que les parasites intracellulaires pouvaient récupérer le PtdEtn lié à l'éther des cellules hôtes.

Nos travaux antérieurs ont rapporté la présence d'une voie fonctionnelle CDP-éthanolamine dans les tachyzoïtes5, bien que nous n'ayons pas pu identifier une alkyl-glycérone phosphate synthase potentielle dans le génome du parasite. Dans les études suivantes, nous avons décrit les première et dernière enzymes de la synthèse de novo de PtdEtn, c'est-à-dire l'éthanolamine kinase (EK) et l'éthanolamine phosphotransférase9,10. Ici, nous avons identifié la protéine ECT, qui utilise la phosphoéthanolamine et le CTP comme substrats pour produire la CDP-éthanolamine25. En comparant avec des homologues des organismes modèles, Saccharomyces cerevisiae, Homo sapiens, Mus musculus et Trypanosoma brucei, nous avons trouvé une ECT potentielle dans le génome de Toxoplasma (TGGT1_310280, Fig. 1). Contrairement aux ECT de mammifères et de kinétoplastides, qui englobent environ 400 résidus et forment des clades distincts, les homologues apicomplexes sont beaucoup plus longs, formant leur propre clade distinct. PfECT et EfECT codent respectivement pour 573 et 665 résidus, tandis que TgECT contient 1128 acides aminés. Les ECT apicomplexes possèdent une extension N-terminale inhabituelle de> 100 résidus par rapport aux homologues canoniques. TgECT est exceptionnel avec une longue extension d'environ 500 acides aminés, résultant en une protéine 3 fois plus grande que ses homologues non apicomplexes (Fig. 1a).

a Structure primaire et proximité phylogénétique des éthanolamines cytidylyltransférases de protistes parasites représentatifs et d'hôtes mammifères. Les séquences protéiques extraites des bases de données Uniprot ou NCBI ont été alignées par Clustal W, et le phylogramme a été construit par le logiciel MEGA 11 (méthode du maximum de vraisemblance, modèle matriciel JTT). L'alignement des ECT peut être vu dans la Fig. 1 supplémentaire. b Un modèle d'homologie tridimensionnelle des domaines de cytidylyltransférase dans TgECT (à droite) et sa superposition avec la structure cristalline de HsECT (gris, PDB : 3ELB, à gauche). c Schéma indiquant le marquage 3'-génomique de TgECT avec un épitope smHA. d PCR génomique confirmant l'intégration de l'étiquette smHA et du marqueur de sélection DHFR-TS au locus ECT. PCR1 et PCR2 ont été utilisés pour tester le locus transgénique, tandis que PCR3 a été inclus comme contrôle pour la souche parentale. e Immunoblot montrant l'expression de TgECT marqué smHA dans la souche transgénique. L'astérisque (*) représente la bande TgECT-smHA correcte (180-kDa). D'autres bandes de taille inférieure sont des produits de dégradation possibles de TgECT-smHA. f Co-localisation immunofluorescente de TgECT-smHA avec TgALD dans les tachyzoïtes (24 h après l'infection). Les cultures parasitées ont été marquées à l'aide d'anticorps α-HA et α-TgALD.

TgECT héberge deux domaines de cytidylyltransférase en tandem d'environ 100 à 150 résidus séparés par une région de liaison, analogue à ses homologues dans d'autres organismes. Cela contraste avec le CTP bactérien : glycérol-3-phosphate cytidylyltransférase ou le CTP eucaryote : phosphocholine cytidylyltransférase (CCT), qui ne contient qu'un seul domaine CT. L'alignement de séquence des domaines ECT typiques a également identifié des résidus conservés (Fig. 1 supplémentaire). Tous les motifs de signature de la famille des cytidylyltransférases sont présents dans la TgECT : HSGH et HVGH ; un motif RTEGISTS ; Régions KWVDEVI et RVVDEVI (Fig. 1 supplémentaire). La modélisation par homologie des domaines TgECT basée sur la structure HsECT (code PDB, 3ELB) suggère que les HSGH, HVGH et RTEGISTS sont impliqués dans la formation d'un centre catalytique, tandis que les KWVDEVI et RVVDEVI permettent la dimérisation des domaines CT N- et C-terminaux (Fig. 1b). Le domaine CT N-terminal dans HsECT et PfECT est essentiel pour leur activité catalytique26,27, ce qui est probablement vrai pour TgECT (Fig. 1a).

La première étape de la voie CDP-éthanolamine produisant la phosphoéthanolamine se produit dans le cytosol9, et la troisième/dernière réaction synthétisant PtdEtn se produit dans le réticulum endoplasmique10. Ici, nous avons examiné la localisation de l'ECT ​​pour déchiffrer l'emplacement subcellulaire de la formation de CDP-éthanolamine. Nous avons généré une souche de parasite transgénique exprimant ECT fusionnée à un monstre spaghetti C-terminal (10xHA) par marquage 3′-génomique. Un amplicon donneur avec les séquences d'homologie 5 'et 3' flanquant la cassette d'expression DHFR-TS résistante à la pyriméthamine (marqueur de sélection) a été co-transfecté dans des tachyzoïtes avec une construction CRISPR codant pour Cas9 et un sgRNA spécifique au gène (Fig. 1c). Les parasites résistants aux médicaments ont été clonés par dilution limite et criblés par PCR génomique pour une intégration au locus souhaité (Fig. 1d). De plus, nous avons confirmé le succès du marquage par western blot, révélant une bande attendue de 180 kDa correspondant à TgECT-smHA dans la souche transgénique mais pas dans la souche parentale (Fig. 1e). La coloration immunofluorescente a révélé une distribution ponctuée d'ECT-smHA dans le parasite, co-localisant avec un marqueur cytosolique connu, l'aldolase (TgAld) 28,29 (Fig. 1f). Pour évaluer la pertinence physiologique de l'ECT ​​au cours du cycle lytique, nous avons tenté de supprimer le gène dans les tachyzoïtes via une double recombinaison homologue assistée par CRISPR/Cas9. Cependant, nos multiples expériences pour obtenir un mutant knock-out viable ont été vaines, ce qui implique que cette protéine est indispensable à la survie des tachyzoïtes.

Dans les travaux suivants, nous avons créé un mutant conditionnel de TgECT basé sur un degron induit par l'auxine, qui dirige les protéines marquées vers la dégradation protéasomique lors de l'incubation avec de l'acide indole-3-acétique (IAA)30. Une construction CRISPR/Cas9 codant pour Cas9 et sgRNA pour cliver l'ECT-3'UTR a été co-transfectée avec un amplicon pour une réparation dirigée par homologie au locus cible dans les tachyzoïtes. La séquence du donneur contenait des bras d'homologie 5 'et 3' (40 pb chacun) flanquant le motif AID-3xHA pour le marquage par insertion 3' et le marqueur de sélection DHFR-TS (Fig. 2a). L'intégration génomique a été examinée par criblage PCR à l'aide d'amorces spécifiques au croisement (Fig. 2a, b), confirmant le marquage du gène 3', qui a été vérifié par séquençage d'ADN. Conformément à TgECT-smHA (Fig. 1f), l'ECT ​​marqué par AID-3xHA était présent dans le cytosol colocalisant avec TgHSP90, un autre marqueur cytoplasmique31 (Fig. 2c). L'immunoblot a révélé une protéine d'environ 180 kDa correspondant à l'ECT ​​marqué par AID-3xHA dans la souche transgénique cultivée sans IAA, tandis que le signal peut être rapidement épuisé en 1 h de traitement par IAA (Fig. 2d). L'épuisement rapide de l'ECT ​​par l'IAA a été confirmé par un test d'immunofluorescence (Fig. 2e, Fig. 2 supplémentaire).

a Le marquage en 3′ médié par CRISPR / Cas9 du gène TgECT avec un degron inductible par l'auxine et 3xHA. La construction pU6-Cas9-TgECTsgRNA (codant pour Cas9 et sgRNA spécifique à l'ECT) a été transfectée avec un amplicon donneur (AID-3xHA-3′UTRGra1-DHFR-TS flanqué de bras d'homologie 5′/3′ de 40 pb) dans le Souche parentale RHΔku80-Δhxgprt-TIR1. Des tachyzoïtes résistants à la pyriméthamine exprimant DHFR-TS ont été clonés et criblés par PCR. L'éventuelle souche TgECT-AID-3xHA a permis une régulation négative conditionnelle de l'ECT ​​par l'acide indole-3-acétique (IAA). b PCR de criblage spécifique à la recombinaison pour déchiffrer l'intégration de AID-3xHA au locus ECT (voir les amorces en a). PCR4/PCR5 et PCR6 indiquent le test des loci transgéniques et natifs, respectivement. c Images immunofluorescentes confirmant la co-localisation de TgECT et TgHSP90 chez le mutant. d, e Expression dépendante de l'IAA de l'ECT ​​marqué par AID-3xHA montrée par des méthodes d'immunoblot et d'immunofluorescence. Les parasites ont été cultivés en l'absence ou en présence de 100 μM d'IAA pendant les périodes de temps indiquées. L'immunomarquage a été effectué à l'aide d'anticorps α-HA et α-TgHSP90 (d) ou α-HA et α-TgGAP45 (e). La quantité équivalente de protéine de chaque échantillon a été résolue sur SDS-PAGE à 8 % pour le transfert, suivi d'une immunocoloration. f, g Plaques produites par TgECT-AID-3xHA et souches parentales (-/+IAA). Les images colorées au cristal violet révèlent des plaques (zone blanche irrégulière) formées par des cycles lytiques successifs des souches indiquées dans des monocouches HFF confluentes (bleu). La taille de la plaque, telle que quantifiée par ImageJ, est présentée en unités arbitraires (au). 150 à 200 plaques de chaque souche ont été notées (n = 3 tests ; moyenne ± SE ; ***p ≤ 0,001).

Un mutant conditionnel nous a permis d'évaluer l'importance de l'ECT ​​pour le cycle lytique du parasite dans les cellules HFF. Nous avons mis en place des tests de plaque, qui indiquent la capacité de croissance globale de T. gondii (Fig. 2f, g). La souche parentale a présenté une croissance normale indépendamment de l'IAA en culture, tout comme le mutant TgECT-AID-3xHA en l'absence d'auxine. En revanche, la déplétion d'ECT induite par l'IAA a arrêté la croissance du parasite, comme en témoigne l'absence de plaques dans la monocouche de cellules hôtes. Ces résultats résonnent avec l'observation précédente selon laquelle le gène ECT ne peut pas être supprimé, confirmant son rôle physiologiquement critique dans T. gondii.

Nous avons ensuite examiné la cause d'un phénotype létal dans des cultures de tachyzoïtes appauvries en ECT par des tests supplémentaires, tels que la réplication, l'endodyogénie (bourgeonnement cellulaire), la sortie, l'invasion et la motilité de glissement (Fig. 3). Pour les deux premières expériences, nous avons choisi des instants correspondant à des cultures parasitées précoces (24 h) et tardives (40 h) (Fig. 3a, b). La réplication a été quantifiée en énumérant les « parasites par vacuole » et en calculant la fraction de vacuoles avec un nombre variable de descendants. Contrairement à la souche parentale, qui n'est pas affectée par l'IAA, le mutant ECT avait une fraction beaucoup plus élevée de petites vacuoles (1 à 8 parasites) dans les cultures traitées à l'auxine aux deux moments par rapport aux échantillons non traités (Fig. 3a). Les grandes vacuoles avec plus de 16 parasites étaient à peine présentes dans des conditions appauvries en ECT, ce qui contraste avec les cultures témoins. En accord, l'évaluation de l'endodyogénie a démontré une formation de cellules filles fortement altérée uniquement chez le mutant TgECT-AID-3xHA traité par l'IAA (Fig. 3b).

a, b La réplication et l'efficacité de bourgeonnement des souches TgECT-AID-3xHA et parentales (-/+IAA). Les tachyzoïtes colorés au TgGAP45 se répliquant dans les vacuoles ont été tracés (parasites / vacuole) pour refléter le taux de prolifération de chaque souche (a). Pour un graphique à barres simplifié avec des points de données, reportez-vous à la Fig. 6 supplémentaire. Le bourgeonnement des cellules filles a été calculé sur la base de la quantification des vacuoles TgIMC3-positives hébergeant des tachyzoïtes avec descendance (b). Les graphiques à barres sont basés sur 400 à 500 vacuoles pour chaque échantillon. c, d Taux de sortie des souches mutantes ECT et parentales dans les conditions −/+ IAA. Pour la sortie naturelle (c) et induite par le zaprinast (d), les résultats ont été obtenus en comptant 30 champs aléatoires avec> 200 vacuoles parasitophores. e Efficacité d'invasion des souches indiquées (−/+IAA). Un total de plus de 1000 événements ont été notés pour les graphiques à barres affichés. f Motilité glissante des tachyzoïtes. Les parasites colorés au TgSAG1 ont été analysés pour la fraction mobile (200 à 400 cellules, n = 4 essais) et la longueur des traînées (> 60 traînées par groupe, à l'exception du TgECT-AID-3xHA traité à l'IAA (13 traînées)). g Le rendement en tachyzoïtes (−/+IAA). Les monocouches HFF (106 cellules) ont été infectées avec les souches indiquées (MoI = 1) et cultivées pendant 48 h avec ou sans IAA, suivies d'un comptage des parasites. Les (a–g) montrent les données de n = 3 expériences ou plus (moyenne ± SE ; *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001).

Le mutant conditionnel présentait également un défaut de sortie naturelle après l'achèvement de la réplication du tachyzoïte (Fig. 3c). Nous avons noté la sortie induite en réponse au zaprinast pour tester si le phénotype observé était dû à une réplication lente et non à une signalisation de sortie altérée. Ce puissant inhibiteur de la phosphodiestérase déclenche une sortie prématurée des tachyzoïtes intracellulaires en activant la signalisation cGMP32,33. En effet, le phénotype de sortie a été sauvé par le zaprinast (Fig. 3d), impliquant une cascade de signalisation intégrale. Notamment, les parasites appauvris en ECT ont très mal envahi les cellules hôtes (Fig. 3e), ce qui suggère l'incapacité du mutant à établir une nouvelle infection. Étant donné que le processus d'invasion est entraîné par la motilité de glissement, nous avons testé ce dernier phénotype (Fig. 3f). Nos données ont révélé une baisse marquée de la fraction mobile et de la longueur de piste du mutant exposé à l'IAA, mais pas dans les échantillons témoins. Les défauts observés dans la motilité, l'invasion et la réplication du parasite ont abouti à une prolifération fortement réduite du mutant conditionnel incubé avec de l'auxine. Son nombre de tachyzoïtes (rendement de parasites) a chuté d'environ 90% lors du traitement à l'IAA par rapport aux cultures témoins (Fig. 3g).

La motilité apicomplexe et les événements d'invasion et de sortie dépendants de la locomotion sont entraînés par un moteur actine-myosine (glideosome) intégré dans le complexe de la membrane interne (IMC)34. La coloration des cellules filles (Fig. 3b) indiquait un organite défectueux, que nous avons examiné en visualisant TgGAP45 - une protéine bien caractérisée essentielle à la fonction du glidéosome 35,36 - dans les tachyzoïtes de la souche TgECT-AID-3xHA (Fig. 4a ). La culture de mutants avec IAA pendant 24 et 48 h a entraîné des parasites manifestement étroits et raccourcis par rapport à la souche parentale (Fig. 4a). Pour consolider notre observation, nous avons mesuré la longueur et la largeur de l'IMC marqué au TgGAP45. Une diminution significative de ces deux dimensions a été enregistrée aux deux moments après le traitement par IAA. Alors que la longueur de l'IMC a été réduite de 10% (Fig. 4b), sa largeur de tachyzoïtes a diminué de 25% lors de l'exposition à l'auxine (Fig. 4c). En supposant une contribution de l'ECT ​​dans la biogenèse membranaire, nous avons également visualisé d'autres organites par immunomarquage, tels que les micronèmes (MIC2), la membrane plasmique (SAG1), l'apicoplaste (ferrédoxine) et la mitochondrie (HSP60) (Fig. 2 supplémentaire). Aucune anomalie morphologique n'était apparente dans aucun des organites immunocolorés. Nous avons également déployé la microscopie électronique à transmission pour déchiffrer les défauts organites potentiels chez le mutant appauvri en TgECT (Fig. 3 supplémentaire), qui ne présentait pas de phénotype distinct par rapport au témoin non traité ou à la souche parentale (-/+ IAA), confirmant notre initiale découvertes par des tests d'immunofluorescence indirecte.

a Des tachyzoïtes de la souche TgECT-AID-3xHA ont été cultivés (-/+ IAA), suivis d'une immunocoloration de TgGAP45. Les noyaux ont été visualisés par DAPI. b, c La longueur de l'IMC et la largeur des tachyzoïtes dans les souches transgéniques et parentales après culture avec ou sans auxine pendant 24 h et 48. Des images de 30 vacuoles parasitophores, chacune avec 4 tachyzoïtes, ont été analysées par ImageJ pour calculer les paramètres indiqués (n = 3 essais, signifie ± SE ; ***p ≤ 0,001).

Compte tenu du rôle putatif de l'ECT ​​dans la synthèse de PtdEtn, nous avons effectué une analyse lipidomique des souches TgECT-AID-3xHA et parentales (Fig. 5). Les lipides totaux ont été isolés des parasites, résolus et analysés par HPLC-MS. Par rapport aux contrôles parentaux et mutants non traités, nous avons observé une baisse d'environ 50% de la teneur en phospholipides de la souche appauvrie en ECT (Fig. 5a). Une diminution significative de toutes les principales classes de phospholipides du mutant traité à l'IAA a été observée, alors qu'aucun changement n'était apparent dans la souche parentale (Fig. 5b). L'abondance des lipides montrés a chuté de 30 à 50% lors de l'épuisement de l'ECT. Nous avons également mesuré les niveaux de PtdEtn lié à l'ester et à l'éther (Fig. 5c). Aucun n'a été modifié dans les cultures -/+ IAA de la souche parentale. Un renversement de l'ECT ​​chez le mutant a provoqué une baisse de l'ester-PtdEtn mais pas de l'éther-lipide (Fig. 5c). Par conséquent, le rapport ester / éther-PtdEtn est passé de 2, 6: 1 dans les cultures non traitées à 1, 1: 1 chez le mutant appauvri en ECT.

a Teneur comparative en phospholipides des souches TgECT-AID-3xHA et parentales. Les parasites ont été cultivés (-/+IAA), suivis d'une analyse lipidomique (n = 4 tests). L'abondance relative de chaque phospholipide dans les échantillons traités à l'IAA est présentée par rapport à la culture témoin non traitée (-IAA, 100%). b Abondance relative des classes de phospholipides standard dans les tachyzoïtes des souches spécifiées (-/+IAA). c Changements dans les pools de PtdEtn liés à l'ester et à l'éther des tachyzoïtes mutants et parentaux. Les données en (a–c) montrent les moyennes avec SE (n = 4 dosages). La signification statistique a été calculée en comparant les échantillons +IAA à -IAA (**p ≤ 0,01 ; ***p ≤ 0,001).

Nous avons ensuite tracé l'ampleur du changement dans toutes les espèces de phospholipides détectables, quelle que soit leur abondance, sous forme de parcelles de volcan pour illustrer le facteur de changement par rapport à la signification statistique lors de la perte d'ECT induite par l'IAA (Fig. 6a, b). Aucune des espèces lipidiques de la souche parentale n'a été affectée au-dessus d'un seuil ≥ 2 fois (valeur p ≤ 0, 01) (Fig. 6a). La souche TgECT-AID-3xHA, en revanche, présentait une régulation substantielle de plusieurs espèces lipidiques correspondant à PtdCho, PtdEtn, PtdIns, PtdSer, PtdThr, lyso-PtdCho et lyso-PtdIns (Fig. 6b, Fig. 4–5 supplémentaires ). Parmi les esters-phospholipides régulés à la baisse, les espèces PtdEtn, PtdSer et PtdThr étaient les plus évidentes (Fig. 6b). Quelques autres, à savoir C36: 1, C38: 4, C40: 5 PtdEtn, C42: 5 PtdSer, C36: 4, C38: 1 PtdCho et C20: 4 lyso-PtdIns ont été régulés à la hausse. Fait intéressant, les éther-lipides appartenant singulièrement à PtdEtn et PtdCho étaient régulés à la hausse ou inchangés chez le mutant (Figs. 6b, 7a).

a Parcelles volcaniques des souches parentales et TgECT-AID-3xHA (en bas) pour représenter les changements dans les espèces de phospholipides individuelles lors de l'exposition à l'IAA. Des seuils définis de changement de pli (≥ 2x) et de valeur p corrigée du taux de fausse découverte (≤ 0, 01) ont été utilisés pour identifier les lipides significativement modifiés (n = 4 tests). Des cercles de différentes tailles, signifiant des espèces individuelles, sont mis à l'échelle de l'abondance; ceux au-dessus du seuil indiqué sont colorés en fonction de la classe de phospholipides, tandis que les autres sont représentés en gris. b Cartes thermiques montrant les changements dans les espèces lipidiques choisies parmi (a). La lettre préfixe "A" indique la forme éther de PtdCho et PtdEtn. Les données de lipidomique sont disponibles dans les feuilles Excel (Supplément Datasheet 1–2).

a L'abondance relative des espèces de PtdEtn liées à l'ester et à l'éther a été considérablement modifiée lors du traitement du TgECT-AID-3xHA avec de l'IAA (Fig. 6). b Schéma pour le marquage isotopique stable des tachyzoïtes mutants TgECT-AID-3xHA extracellulaires et intracellulaires (-/+ IAA) avec [13C2]-éthanolamine et [13C2]-PtdEtn dérivé de l'hôte, respectivement. Pour ce dernier test, les HFF ont été cultivés dans du [13C2]-éthanolamine pour marquer le PtdEtn, suivis de la propagation des tachyzoïtes pour tester la récupération du [13C2]-PtdEtn. L'incorporation de [13C2] dans les espèces ester- et éther-PtdEtn de parasites purifiés a été jugée par analyse lipidomique. c, d Enrichissement en [13C2]-éthanolamine en espèces PtdEtn à liaison ester et éther de tachyzoïtes extracellulaires et intracellulaires, comme décrit en (b). Les données en (a, c, d) montrent les moyennes avec SE (a, n = 4 dosages ; c, d, n = 5 dosages).

La synthèse interdépendante des phospholipides nous a motivés à trouver des modèles dans leur co-régulation. Une perte d'ECT a modifié plusieurs espèces, en particulier celles partagées par PtdSer, PtdThr et PtdEtn. C34: 2, C38: 6, C38: 7, C40: 7 PtdSer et C38: 6, C38: 7 PtdThr correspondaient à la tendance des espèces PtdEtn (Fig. 4 supplémentaire), suggérant leur synthèse par les enzymes d'échange de bases PSS et PTS chez T. gondii7. Il y avait à peine une espèce commune PtdEtn et PtdCho (Fig. 6b), ratifiant l'absence d'une lipide méthyltransférase5. De même, aucune corrélation des espèces de PtdEtn avec les PtdIns n'a été observée, comme prévu par les voies souveraines de leurs synthèses12,25. De manière frappante, certaines espèces de PtdCho (36: 4, 38: 1), PtdEtn (36: 1, 38: 4, 40: 4, 40: 5) et PtdSer (42: 5) ont été induites chez le mutant privé d'ECT ( Fig. 3b supplémentaire), indiquant un mécanisme de contrepoids. Cependant, aucune des espèces de PtdEtn spécifiées n'était marquée au 13C2 dans les tachyzoïtes extracellulaires ou dans celles cultivées dans des cellules hôtes pré-marquées (Fig. 7b, c, voir ci-dessous). Ces espèces ester-PtdEtn sont donc probablement formées par les PSD10,21.

Contrairement à sa forme ester, les espèces éther-PtdEtn ont été augmentées ou non affectées (Fig. 7a), nous incitant à rechercher les enzymes de synthèse éther-PtdEtn chez T. gondii. Comme mentionné ci-dessus, notre analyse bioinformatique n'a pas trouvé de candidat approprié dans le génome du parasite. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que la voie Kennedy fournit le PtdEtn lié à l'ester et que la production d'éther-lipides dépend du milieu du parasite. Pour tester cette prémisse, nous avons effectué le marquage isotopique (13C2-éthanolamine) suivi d'une analyse lipidomique, ce qui nous a permis de distinguer les espèces PtdEtn synthétisées par le parasite de celles récupérées des cellules hôtes (Fig. 7b). Semblable au marquage 13C6-myo-inositol précédemment rapporté de PtdIns12, des parasites sans hôte marqués avec 13C2-éthanolamine ont été analysés pour discerner le PtdEtn fabriqué de manière endogène. Dans le même temps, des tachyzoïtes cultivés dans des cellules hôtes pré-marquées ont été déployés pour déduire l'occurrence d'une voie de sauvetage.

L'analyse lipidomique des parasites extracellulaires a révélé un enrichissement en 13C2-éthanolamine dans plusieurs espèces d'ester-PtdEtn, telles que C34: 1 (> 5 fois), C34: 2 (∼ 11x), C36: 2 (∼ 10x), C38: 4 (∼6x) et C40:5 (∼6x) (Fig. 7c), qui ont confirmé la présence d'une voie fonctionnelle CDP-éthanolamine5,10. L'appauvrissement en ECT médié par l'IAA a altéré le marquage isotopique des espèces C34: 1, C34: 2 et C36: 2, conformément à la baisse observée de leur contenu (Fig. 7a). En revanche, le marquage au 13C2 de C38: 4 et C40: 5 PtdEtn n'a pas été affecté par l'IAA (Fig. 7c) en accord avec leurs niveaux non perturbés ou accrus (Fig. 7a). Les tachyzoïtes cultivés dans des cellules hôtes marquées au 13C2-éthanolamine n'ont montré d'enrichissement isotopique dans aucune des espèces d'ester-PtdEtn excluant la récupération de ces lipides (Fig. 7c). Inversement, nous avons observé un phénomène opposé pour les espèces ester-PtdEtn (A34: 2, A36: 5) enrichies en 13C2 (∼ 4–5x) en parasites à croissance intracellulaire mais pas en parasites sans hôte (Fig. 7d). D'autres espèces lipidiques (A38: 5, A38: 6, A40: 6) ont été marquées de manière égale dans les deux paramètres (∼ 2–3x) et, comme prévu, aucun changement dans le marquage 13C2 de l'éther-PtdEtn n'a été observé lors de l'épuisement de l'ECT. Les données impliquent que les espèces ester-PtdEtn sont synthétisées principalement de novo en utilisant la voie CDP-éthanolamine, tandis que le parasite récupère les espèces PtdEtn liées à l'éther de sa cellule hôte.

Comprendre la base métabolique du parasitisme intracellulaire chez les parasites apicomplexes a été au cœur de la recherche pathogène-hôte. Au cours des trois dernières décennies, Toxoplasma gondii est devenu un parasite modèle pour découvrir la biologie apicomplexe en raison de la relative facilité de culture et des outils avancés pour l'ingénierie du génome et le phénotypage mutant. Bien qu'étudiés activement, la biosynthèse des lipides, le trafic, la récupération, la détection et la signalisation restent encore mal appréciés chez Apicomplexa. En explorant une phosphoéthanolamine cytidylyltransférase (ECT), ce travail a déterminé que les tachyzoïtes de T. gondii déploient des voies distinctes pour répondre à leur besoin d'espèces PtdEtn liées à l'ester et à l'éther (Fig. 8). Alors que les premiers lipides sont générés par la voie Kennedy, le second type est récupéré des cellules hôtes. L'ECT est une protéine essentielle facilitant l'invasion et la réplication des parasites au cours du cycle lytique. Ces caractéristiques et sa divergence phylogénétique par rapport aux homologues mammifères font de la TgECT une excellente cible médicamenteuse pour l'inhibition thérapeutique de la toxoplasmose aiguë.

Le modèle est basé sur ce travail et sur les travaux antérieurs cités ici. Les tachyzoïtes déploient plusieurs voies pour produire PtdEtn. La demande d'ester-PtdEtn est satisfaite principalement via les voies CDP-éthanolamine et PSD1mt. Le premier entraîne la synthèse de novo d'ester-PtdEtn dans le RE, tandis que le second génère du PtdEtn en décarboxylant PtdSer dans la mitochondrie. L'ECT, située dans le cytosol du parasite, est la deuxième enzyme limitante de la voie CDP-éthanolamine. Il est essentiel à la survie du parasite, et son knockdown conditionnel chez le mutant TgECT-AID-3xHA par IAA conduit à un déclin de nombreuses espèces PtdEtn, PtdSer et PtdThr. Les deux derniers lipides sont probablement fabriqués à partir de PtdEtn via les réactions d'échange de bases entraînées par les enzymes PSS et PTS dans le RE. La perte d'ECT altère le complexe de la membrane interne, ce qui peut sous-tendre des défauts de motilité de glissement, d'invasion et de division cellulaire. Le besoin du parasite en PtdEtn lié à l'éther est satisfait par la récupération de la cellule hôte. Il n'est pas clair si les tachyzoïtes intracellulaires importent l'ester-PtdEtn dérivé de PSD1pv. Les P4-ATPases résidant à la surface du parasite peuvent jouer un rôle dans le retournement de PtdEtn lié à l'éther et à l'ester.

Notre travail suggère le rôle de la voie CDP-éthanolamine dans la fabrication de l'ester-PtdEtn. Les niveaux de nombreuses espèces d'ester-PtdEtn ont été réduits dans le mutant ECT. Les quantités non perturbées et régulées à la hausse d'autres lipides spécifiques indiquent la présence fonctionnelle et la contribution de voies supplémentaires. Ester-PtdEtn peut être généré par PSD1mt et PSD1pv (Fig. 8)10,21. De plus, au moins les tachyzoïtes extracellulaires sont capables de récupérer PtdEtn15,20, et il est plausible que lorsqu'ils sont intracellulaires, ils puissent acquérir du PtdEtn dérivé de PtdSer fabriqué dans la vacuole parasitophore par catalyse de PSD1pv. Enfin, le réticulum endoplasmique de l'hôte et les mitochondries recrutées sur la membrane vacuolaire sont les principaux sites de synthèse de PtdSer et PtdEtn dans les cellules de mammifères et servent éventuellement de source supplémentaire de ces lipides. Fait intéressant, les tachyzoïtes PSD1mt-knockout peuvent survivre dans des cultures prolongées et montrer une régulation positive de la voie CDP-éthanolamine 10 ; cependant, l'inverse ne semble pas vrai car l'ECT ​​est essentielle pour le cycle lytique. Nous proposons que des réactions distinctes entraînent la synthèse d'espèces discrètes d'ester-PtdEtn, et que celles codées par la voie Kennedy ne peuvent pas être équilibrées par d'autres moyens, conduisant à un phénotype létal chez le mutant ECT.

La pertinence physiologique de la voie Kennedy a également été étudiée chez d'autres protistes parasites, notamment T. brucei et P. bergei37,38. Les enzymes sous-jacentes seraient essentielles pour ces parasites même si elles hébergent des enzymes PSD fonctionnelles. L'appauvrissement en TbECT a altéré la prolifération du parasite, en corrélation avec une teneur réduite en PtdEtn et une morphologie inhabituelle chez T. brucei37. Ces résultats reflètent le phénotype des tachyzoïtes appauvris en ECT de T. gondii. La perte conditionnelle de TgECT a abrogé l'invasion et la réplication du parasite, en même temps qu'un IMC anormal pouvant être attribué à une composition phospholipidique dérégulée (éventuellement des espèces de PtdEtn). Hébergant le glideosome, un complexe moteur entraînant la motilité du parasite34, l'IMC est crucial pour le cycle lytique. Sa perturbation lors de la perte de TgECT peut entraîner un dysfonctionnement du glideosome, entraînant une altération de la motilité, une invasion et une sortie des tachyzoïtes. En outre, un rapport asymétrique entre l'ester et le PtdEtn lié à l'éther chez le mutant peut affecter la fluidité membranaire et la cytokinèse, comme décrit dans les cellules de mammifères23.

Nos données suggèrent également que PtdEtn sert de donneur pour synthétiser PtdSer et PtdThr via une réaction d'échange éthanolamine-sérine ou thréonine catalysée par les protéines PSS et PTS, respectivement (Fig. 8). Notamment, quelques espèces de PtdEtn (36: 1, 38: 4, 40: 4, 40: 5) n'étaient pas affectées ou même élevées lors de l'épuisement de l'ECT. Ils sont probablement fabriqués par décarboxylation PtdSer, qui mérite une analyse lipidomique des mutants PSD1mt et PSD1pv. Aucun parallèle n'était évident dans la modulation des espèces PtdCho et PtdIns avec celle de PtdEtn, se répercutant sur les voies de synthèse indépendantes des deux premiers phospholipides4,5,12. Il est important de noter que cette étude révèle la récupération d'espèces d'éther-PtdEtn dérivées de l'hôte par des parasites intracellulaires (Fig. 8). Alors que les tachyzoïtes sont connus pour produire du diacylglycérol pour la fabrication de l'ester-PtdEtn18, une véritable alkyl-glycérone phosphate synthase pour produire l'échafaudage alkyl-glycérol de l'éther-PtdEtn n'a pas pu être trouvée dans le génome du parasite. La présence de lipides liés à l'éther dans les tachyzoïtes est énigmatique. On rapporte qu'ils ont des effets « redox » dans les cellules de mammifères22,24. Certaines cellules en culture qui en sont dépourvues deviennent plus sensibilisées aux dommages oxydatifs. De même, le caractère pro-oxydant de ces lipides a également été décrit39. Les travaux futurs devraient se concentrer sur la dissection de la machinerie de sauvetage et l'importance fonctionnelle des éther-lipides dans les tachyzoïtes de T. gondii.

En conclusion, ce travail démontre que la TgECT est une enzyme vitale contribuant à la synthèse de l'ester-PtdEtn. Son épuisement conditionnel altère la biogenèse membranaire, la réplication et l'invasion des tachyzoïtes. Nous révélons une collaboration de synthèse endogène, d'interconversion et de voies de récupération pour produire PtdEtn. En particulier, les données montrent un nettoyage jusqu'alors inconnu d'espèces de PtdEtn liées à l'éther dérivées de l'hôte par le parasite et offrent une base solide pour le ciblage thérapeutique de la synthèse de PtdEtn chez T. gondii.

La souche RH∆ku80∆hxgprt-TIR1 de T. gondii, le plasmide pLinker-AID-3xHA-HXGPRT pour le marquage AID-3xHA40, les anticorps anti-TgALD et anti-TgMIC2 ont été fournis par David Sibley (Washington University, St. Louis, ETATS-UNIS). D'autres anticorps primaires se liant à TgGAP45, TgHSP90, TgIMC3 et TgFerredoxin ont été proposés par Dominique Soldati-Favre (Université de Genève, Suisse), Sergio O. Angel (IIB-INTECH, Argentine), Marc-Jan Gubbels (Boston College, USA) et Frank Seeber (Institut Robert-Koch, Berlin), respectivement. L'anticorps primaire contre la TgHSP60 et le sérum de porc anti-Tg ont été produits au State Key Laboratory of Agricultural Microbiology (Wuhan, Chine). D'autres anticorps primaires dirigés contre l'épitope de l'hémagglutinine (HA) et le TgSAG1 ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (Allemagne) et ThermoFisher Scientific (Allemagne), respectivement. Les anticorps secondaires pour l'immunocoloration (Alexa488, Alexa594, IRDye 680RD, 800CW) et les oligonucléotides (tableau supplémentaire 1) ont été achetés auprès de Life Technologies (Allemagne). Les réactifs de culture cellulaire ont été achetés auprès de PAN Biotech (Allemagne). D'autres produits chimiques standard ont été fournis par Sigma-Aldrich et Carl Roth (Allemagne). Les kits de réactifs pour le clonage ont été acquis auprès d'Analytik Jena et de Life Technologies (Allemagne). Les étalons lipidiques ont été fournis par Avanti Polar Lipids (USA).

Des fibroblastes de prépuce humain (HFF) ont été utilisés comme cellules hôtes pour propager les tachyzoïtes de T. gondii. Les cellules ont été récoltées par trypsinisation (0,25 % de trypsine-EDTA) et ensemencées dans des flacons, des boîtes ou des lamelles, selon les exigences des tests individuels. Les monocouches confluentes ont été infectées un jour sur deux pour maintenir les tachyzoïtes. Les cultures ont été réalisées dans du DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) additionné de glucose (4,5 g/L), de sérum bovin fœtal (10 %, PAN Biotech, Allemagne), de glutamine (2 mM), de pyruvate de sodium (1 mM), de pénicilline (100 U/mL), streptomycine (100 μg/mL) et minimum d'acides aminés non essentiels de Eagle (100 μM chacun) à 37 °C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié. Pour la plupart des tests, les tachyzoïtes ont été libérés des cultures parasitées à un stade avancé en grattant et en faisant gicler des seringues de calibre 23 et 27. Les parasites extracellulaires ont été utilisés directement pour les essais en aval.

Des tachyzoïtes (~ 107) ont été transfectés avec 10 µg de constructions plasmidiques dans un cytomix stérile sur filtre (KCl 120 mM, CaCl2 0,15 mM, K2HPO4/KH2PO4 10 mM, HEPES 25 mM, EGTA 2 mM, MgCl2 5 mM additionné de glutathion frais 5 mM et ATP 5 mM, pH 7,6). Les parasites ont ensuite été sélectionnés avec le médicament correspondant au marqueur de sélection codé par le plasmide transfecté. Les parasites transgéniques résistants aux médicaments ont été clonés par dilution limitante dans des plaques à 96 puits contenant des cellules HFF. Les clones individuels avec la manipulation génétique souhaitée ont été identifiés par criblage PCR et tests d'immunocoloration. Pour générer la souche TgECT-AID-3xHA, un amplicon donneur comprenant le marqueur de sélection AID-3xHA-TgGRA1-3'UTR et DHFR-TS flanqué de bras homologues courts (40 pb) pour un croisement au locus ECT a été co-transfecté avec une construction CRISPR-Cas9 dans la souche RH∆ku80∆hxgprt-TIR1. Pour générer la souche TgECT-smHA, une construction plasmidique exprimant le sgRNA spécifique de Cas9 et TgECT a été transfectée avec un amplicon PCR comprenant 10xHA et une cassette d'expression DHFR-TS dans la souche RHΔku80-hxgprt−. Les parasites mutants ont été sélectionnés par 1 µM de pyriméthamine et criblés par PCR pour le marquage AID-3xHA ou smHA d'ECT.

Le test a été exécuté, comme indiqué précédemment41. Les cellules HFF ont été ensemencées et cultivées à confluence sur les lamelles de verre placées dans des plaques à 24 puits. Des parasites fraîchement libérés ont été utilisés pour infecter les monocouches HFF. Les cellules hôtes parasitées ont été lavées avec du PBS et fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min, puis neutralisées dans de la glycine/PBS 0,1 M. Les échantillons ont été perméabilisés par 0,2 % de Triton-X100/PBS (20 min) et bloqués avec 2 % de BSA préparé dans 0,2 % de Triton-X100/PBS (20 min). Les cellules ont finalement été colorées avec le primaire correspondant (α-HA, 1:3000; α-TgGAP45, 1:5000; α-TgIMC3, 1:2000; α-TgALD, 1:1000; α-TgFerredoxin, 1:500; TgSAG1 , 1:1000; sérum porcin anti-Tg, 1:1000, TgMIC2, 1:1000) et anticorps secondaires (Alexa488, Alexa594, 1:3000) pendant 1 h chacun. Les échantillons ont été lavés au PBS entre les différentes étapes de traitement et montés dans du DAPI-Fluoromount G pour l'imagerie (Carl-Zeiss, Allemagne).

Des tests phénotypiques ont été mis en place avec des parasites frais libérés par seringue, comme indiqué précédemment7,12,32. En bref, des essais sur plaque ont été effectués dans des plaques à 6 puits en infectant des monocouches HFF confluentes avec 200 parasites/puits, suivies d'une incubation non perturbée (-/+ 100 µM d'IAA dans de l'éthanol à 0, 1 %) pendant 7 jours. Le solvant porteur a été inclus dans les échantillons non traités. Les cultures ont été fixées avec du méthanol froid (15 min) et colorées avec du cristal violet (15 min). Les plaques ont été quantifiées à l'aide de la suite ImageJ (NIH, Bethesda). Pour les tests de réplication et d'endodyogénie, les monocouches HFF confluentes sur des lamelles ont été infectées (MoI: 1, 24 h, 40 h), suivies d'une fixation et d'une coloration avec des anticorps α-TgIMC3 et α-TgGAP45. La division cellulaire a été évaluée en énumérant les parasites se reproduisant dans leurs vacuoles parasitophores. Pour déterminer la motilité de glissement, les tachyzoïtes ont été pré-cultivés avec de l'IAA pendant 48 h (le cas échéant). Ensuite, 4 × 105 parasites en suspension dans une solution saline équilibrée de Hank sans Ca2+ (−/+ IAA) ont été décantés (400 g, 5 min, température ambiante), suivis d'une incubation (15 min, 37 °C) sur des lamelles recouvertes de 0,01 % BSA. Pour visualiser les parasites et les traînées, les échantillons ont été colorés par les anticorps α-TgSAG1 et Alexa488. Les fractions mobiles ont été estimées directement au microscope, tandis que les longueurs de piste ont été quantifiées à l'aide du logiciel ImageJ.

Pour le test d'invasion, les tachyzoïtes ont été pré-cultivés dans 100 µM d'IAA ou le solvant porteur pendant 40 h, puis utilisés pour infecter les cellules hôtes sur des lamelles (MoI : 10, 1 h). Les échantillons ont été fixés, neutralisés et colorés, comme indiqué ailleurs32. Les parasites non envahis (extracellulaires) ont été immunocolorés pour TgSAG1 avant la perméabilisation au détergent des cultures. Les échantillons ont été lavés avec du PBS, perméabilisés et colorés pour la protéine TgGAP45 afin de visualiser les tachyzoïtes envahis (intracellulaires). Les cultures ont été lavées avec du PBS, marquées avec des anticorps secondaires (Alexa488, Alexa594) et montées dans DAPI-Fluoromount G pour l'imagerie fluorescente (Carl-Zeiss, Allemagne). Le pourcentage de parasites envahis (efficacité d'invasion) a été compté par les parasites bicolores. Pour les tests de sortie naturelle, les HFF cultivés sur des lamelles ont été infectés par des parasites (MoI: 2, 40 h/64 h, -/+ 100 µM IAA), suivis d'une coloration en deux étapes (comme dans le test d'invasion) pour distinguer le perturbé et intact vacuoles32.

Une seule expérience de sortie naturelle nous a obligés à vérifier la vacuole du parasite à deux moments, un avant la sortie pour déterminer les PV totaux (40 h) et un après la sortie pour marquer les PV restants (64 h). À 40 h, les tachyzoïtes étaient sur le point de sortir mais pas, alors qu'à 64 h, tous les parasites des souches parentales étaient sortis. Le taux de sortie (%) a été calculé comme [nombre de PV intacts (40 h) - nombre de PV intacts (64 h)]/nombre de PV totaux (40 h) × 100. Pour la sortie induite, les cultures parasitées (MoI : 1, 24 h) ont été traités avec du zaprinast 500 µM (30 min). Ici, un point de temps plus tôt (infection de 24 h, 8-16 parasites/vacuole) a été choisi pour s'assurer qu'aucune sortie ne s'est produite dans des conditions non induites. Pour quantifier le rendement en parasites, des cellules hôtes (106) dans des boîtes de culture (3 cm) ont été infectées par des tachyzoïtes (106 parasites, MoI : 1) et la progéniture a été comptée après la libération de la seringue (27 G) à 48 h.

Nous avons sélectionné une infection de 48 h pour la collecte d'échantillons sur la base du test de rendement parasitaire. Les lipides ont été extraits de culots frais de tachyzoïtes purifiés (1 × 107/échantillon), comme indiqué précédemment7. Les lipides isolés ont été séchés sous un courant d'azote et dissous dans 100 μL de chloroforme et de méthanol (1:1), dont 10 μL ont été injectés sur une colonne Acquity BEH C18 UPLC (2,1 × 100 mm, 1,7 μm) maintenue à 60 °C . La séparation des espèces lipidiques a été réalisée avec un gradient de méthanol et d'acétonitrile dans l'eau, tous deux contenant 2,5 mM d'acétate d'ammonium. Le gradient d'élution, à un débit de 600 µL/min, a été programmé comme suit (temps en min, % B) : (0, 12,5), (7,5, 100), (14, 100), (14,1, 87,5) , (17, 87.5). L'effluent a été soumis à une ionisation par électropulvérisation chauffée dans un instrument Sciex X500R QToF. Des spectres MS2 dépendants des données ont été collectés (plage MS1 400-1050 amu ; précurseur > 600 amu ; plage MS2 50-1050 amu) avec un temps d'accumulation de 150 ms, une énergie de collision de 35 V et un étalement CE de 15 V. a été fait en utilisant le module Analytics de SciexOS et MSDial42.

Le dosage a été effectué comme décrit précédemment pour [13C6]-myo-inositol12. Pour étiqueter les parasites extracellulaires avec [13C2]-éthanolamine (Sigma-Aldrich, Allemagne), le mutant TgECT-AID-3xHA a été précultivé sans ou avec 100 μM d'IAA pendant 48 h, suivi d'une libération de seringue, d'un lavage au PBS et d'un filtrage à travers 5 μm filtre pour enlever les débris. Les parasites (1 × 107) ont ensuite été mis en suspension dans 100 μL de DMEM (-/+ IAA) contenant 0, 5 mM de [13C2] -éthanolamine et incubés à 37 ° C pendant 6 h avant l'analyse lipidomique. Pour le marquage intracellulaire des parasites dans les HFF hébergeant [13C2]-PtdEtn, les cellules hôtes dans des flacons T-175 ont été cultivées jusqu'à confluence dans 25 μM de [13C2]-éthanolamine. Les cultures ont été lavées avec du PBS pour éliminer l'isotope en excès du milieu et infectées par des parasites en présence d'un excès de 50 × (1, 25 mM) d'éthanolamine pour empêcher l'inclusion d'isotope accumulé de manière intracellulaire dans le PtdEtn produit de manière endogène des tachyzoïtes proliférants. Les parasites descendants ont été analysés pour les espèces de PtdEtn liées à l'ester et à l'éther.

Les monocouches HFF dans des flacons T75 ont été infectées par des tachyzoïtes (MoI = 2) pendant 48 h. Les cellules parasitées ont été scarifiées, lavées avec du PBS et fixées pendant une nuit dans du glutaraldéhyde à 2,5 % (v/v)/PBS (0,1 M, pH 7,2) à 4 °C. Les échantillons ont été lavés avec du PBS (3 ×, 30 min à température ambiante), post‐fixés dans du tétroxyde d'osmium à 1 % (p/v) pendant 2 h, relavés avec du PBS pendant 30 min et déshydratés dans une série graduée de concentrations d'acétone. Les blocs déshydratés ont été progressivement infiltrés et inclus dans de la résine Spurr (SPI Chem, USA), puis polymérisés à 65 °C pendant 48 h. Les échantillons ont été découpés en sections ultrafines (60 à 70 nm d'épaisseur) avec un couteau en diamant, colorés avec de l'acétate d'uranyle à 2 % et imagés à 80 kV à l'aide d'un microscope électronique à transmission (H‐7650, Hitachi, Japon).

Sauf indication contraire, les données présentées dans les graphiques sont présentées comme la moyenne avec SE de trois expériences utilisant des clones de parasites représentatifs. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du programme GraphPad Prism (CA, USA). La signification a été testée par un test t bilatéral non apparié avec une variance égale (*p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001). Nous avons introduit le taux de fausses découvertes pour les tests de comparaison multiple.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données générées et/ou analysées au cours de cette étude sont fournies dans l'article principal (Fig. 1 à 8) et dans des fichiers supplémentaires (Fig. 1 à 6 supplémentaires, Tableau 1). Les images originales de gel, de transfert et de plaque sont présentées dans la Fig. 6 supplémentaire. Les données sources des graphiques et des images se trouvent dans les fichiers Excel supplémentaires (Données supplémentaires 1–2). Toutes les ressources sont également disponibles auprès des auteurs sur demande raisonnable.

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Nous remercions Grit Meusel (Humboldt University, Berlin) pour son assistance technique et Limin He (Huazhong Agricultural University, Wuhan) pour son soutien aux travaux de microscopie électronique. Nous sommes également reconnaissants à la communauté Toxoplasma pour le partage des ressources indiquées. Ce travail a été principalement parrainé par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) dans le cadre du programme Heisenberg (GU1100/16) et de la subvention de projet (GU1100/17) attribuée à Nishith Gupta. Un financement supplémentaire a été fourni à Bang Shen par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC, 31961133032, co-PI : Nishith Gupta) et à Nishith Gupta par le DBT–Wellcome Trust (India Alliance, IA/S/19/1/504263) . Nous reconnaissons également le financement du DFG pour le lancement de la coopération internationale (GU1100/15), soutenant une visite à court terme de Bang Shen aux laboratoires Gupta. La recherche collaborative de Xiaohan Liang à l'Université Humboldt de Berlin a été parrainée par un programme de mobilité universitaire (M0074) doté à Nishith Gupta et Bang Shen par le Centre sino-allemand pour la promotion de la recherche (CDZ). Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception, la collecte de données, l'analyse, la préparation ou la décision de publier ce travail. Les données de cette publication ont été générées principalement à l'Université Humboldt de Berlin (HUB). Le soutien du HUB Open Access Publication Fund pour couvrir le coût de cet article est grandement apprécié.

Financement Open Access activé et organisé par Projekt DEAL.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Bingjian Ren, Xiaohan Liang.

Département de parasitologie moléculaire, Faculté des sciences de la vie, Université Humboldt, Berlin, Allemagne

Bingjian Ren et Nishith Gupta

Laboratoire clé d'État de microbiologie agricole, Université agricole de Huazhong, Wuhan, Chine

Xiaohan Liang, Bang Shen et Nishith Gupta

Groupe de recherche sur les techniques d'analyse dans les sciences de la vie, École des sciences et technologies de la vie, Université des sciences appliquées d'Avans, Breda, Pays-Bas

Jos F. Brouwers

Intracellular Parasite Education and Research Labs (iPEARL), Département des sciences biologiques, Birla Institute of Technology and Science, Pilani (BITS-P), Hyderabad, Inde

Nous sauvons Cross Miron et Nishith Gupta

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NG a conceptualisé et supervisé le projet ; BR, XL et RCM ont réalisé des expériences ; BR, XL et NG ont analysé les données et rédigé le document ; JB a effectué l'analyse lipidomique ; NG et BS ont acquis et géré le financement. Tous les auteurs ont révisé, édité et approuvé l'article.

Correspondance avec Bang Shen ou Nishith Gupta.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent. NG est membre du comité de rédaction de la revue Communications Biology, mais n'a pas été impliqué dans la révision éditoriale ni dans la décision de publier cet article.

Communications Biology remercie Hayley (E) Bullen et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteur en chef de la manipulation principale : George Inglis.

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Réimpressions et autorisations

Ren, B., Liang, X., Brouwers, JF et al. Synthèse par rapport à la récupération de la phosphatidyléthanolamine liée à l'ester et à l'éther dans le pathogène protozoaire intracellulaire Toxoplasma gondii. Commun Biol 6, 306 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04664-x

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Reçu : 25 septembre 2022

Accepté : 06 mars 2023

Publié: 22 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04664-x

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