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Dec 05, 2023

Suppression de l'autisme

Volume Biologie des communications

Communications Biology volume 6, Article number: 593 (2023) Citer cet article

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CHD8 code pour la protéine 8 de liaison à l'ADN de l'hélicase du chromodomaine et sa mutation est un facteur de risque hautement pénétrant pour les troubles du spectre autistique (TSA). CHD8 sert de régulateur transcriptionnel clé sur la base de son activité de remodelage de la chromatine et contrôle ainsi la prolifération et la différenciation des cellules progénitrices neurales. Cependant, la fonction de CHD8 dans les neurones postmitotiques et le cerveau adulte est restée incertaine. Ici, nous montrons que la suppression homozygote de Chd8 dans les neurones postmitotiques de souris entraîne une régulation négative de l'expression des gènes neuronaux et modifie l'expression des gènes dépendants de l'activité induits par la dépolarisation neuronale médiée par le KCl. De plus, l'ablation homozygote de CHD8 chez la souris adulte était associée à une atténuation des réponses transcriptionnelles dépendantes de l'activité dans l'hippocampe aux crises induites par l'acide kaïnique. Nos résultats impliquent CHD8 dans la régulation de la transcription dans les neurones postmitotiques et le cerveau adulte, et ils suggèrent que la perturbation de cette fonction pourrait contribuer à la pathogenèse des TSA associée à l'haploinsuffisance de CHD8.

Le trouble du spectre autistique (TSA) est une affection hétérogène définie par des déficits d'interaction sociale et de communication ainsi que par des comportements restreints et répétitifs. Les personnes atteintes de TSA manifestent souvent des symptômes supplémentaires tels que des convulsions, de l'anxiété et une déficience intellectuelle1. Le dysfonctionnement synaptique est une caractéristique clé de la pathologie des TSA et est également apparent dans le cerveau de divers modèles murins de la maladie2,3,4. L'activité neuronale déclenchée par les expériences contribue à la régulation du développement synaptique et de la fonction dans les circuits neuronaux en induisant la transcription de plusieurs gènes5,6, suggérant que le dysfonctionnement d'une telle régulation transcriptionnelle dépendante de l'activité peut contribuer au développement des TSA.

Les mutations du gène codant pour la protéine 8 (CHD8) de liaison à l'ADN de l'hélicase du chromodomaine constituent un facteur de risque hautement pénétrant pour le TSA7,8. CHD8 est un facteur de remodelage de la chromatine dépendant de l'ATP qui cible les régions promotrices de nombreux gènes, y compris ceux d'autres gènes associés aux TSA, et régule ainsi leur transcription9,10,11. Il a été constaté que les souris mutantes hétérozygotes Chd8 manifestent une macrocéphalie, un comportement anxieux accru, un comportement social altéré et des déficits cognitifs, mais les phénotypes comportementaux de différentes lignées de souris mutantes Chd8 générées par différents groupes ne se chevauchent que partiellement12,13,14,15,16 ,17. La perte de CHD8 entraîne également une prolifération et une différenciation altérées des cellules précurseurs des neurones excitateurs du cerveau antérieur et des cellules granulaires cérébelleuses au cours du développement cortical et cérébelleux18,19. De plus, CHD8 joue un rôle clé dans la différenciation et la myélinisation des oligodendrocytes, et son ablation dans les cellules précurseurs des oligodendrocytes de souris entraîne le développement de certains des phénotypes comportementaux caractéristiques des souris mutantes hétérozygotes Chd820,21,22. Bien que ces diverses observations impliquent CHD8 en tant que régulateur central de la prolifération et de la différenciation des cellules progénitrices dans le cerveau, on ignore si CHD8 joue également un rôle important dans les neurones postmitotiques et le cerveau adulte.

Nous avons maintenant examiné les conséquences de la délétion de Chd8 dans les neurones postmitotiques de souris à la fois in vitro et dans le cerveau adulte in vivo avec l'utilisation d'un système de recombinaison Cre inductible par le tamoxifène. Nous avons découvert que CHD8 régule l'expression des gènes neuronaux et des gènes dépendants de l'activité dans les neurones en culture. Nous avons également constaté que la suppression de Chd8 dans le cerveau adulte entraîne une régulation négative de l'expression génique dépendante de l'activité associée aux crises induites par l'acide kaïnique (KA). Nos résultats indiquent que CHD8 sert de régulateur transcriptionnel non seulement dans les cellules progénitrices neurales mais aussi dans les neurones postmitotiques.

Pour étudier le rôle de CHD8 dans les neurones postmitotiques, nous avons cultivé des neurones primaires de l'hippocampe dérivés de souris knock-out Chd8 médiées par la recombinase Cre (CAG-CreER/Chd8F/F) et de souris témoins (Chd8F/F) au jour embryonnaire (E) 18,5 (Fig. 1a). Les cultures ont été traitées avec de la cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) pour éliminer les cellules en division, puis ont été exposées au 4-hydroxytamoxifène (4-OHT) pour générer des neurones inactivés conditionnels Chd8 (Chd8 CKO). L'abondance de l'ARNm de Chd8 dans les cultures de Chd8 CKO était considérablement réduite par rapport à celle des cultures témoins (Fig. 1b). Les cellules cultivées comprenaient ~ 17% d'astrocytes et ~ 1% d'oligodendrocytes en plus des neurones, mais la proportion de chaque type de cellule et la viabilité cellulaire étaient similaires pour Chd8 CKO et les cultures témoins (Fig. 1c, Fig. 1 supplémentaire). Nous avons effectué une analyse de séquençage d'ARN (ARN-seq) avec ces neurones Chd8 CKO et témoins (tableau supplémentaire 1). L'expression de 509 gènes était régulée à la baisse et celle de 360 ​​gènes était régulée à la hausse dans les neurones CKO Chd8 par rapport aux neurones témoins (taux de fausse découverte (FDR) - valeur P ajustée <0, 05) (Fig. 1d). L'analyse de l'ontologie génique (GO) a révélé que les 509 gènes sous-régulés dans les neurones Chd8 CKO étaient enrichis en gènes liés à la "traduction", à la "transcription, à l'ADN", au "développement du système nerveux" et à la "régulation positive de l'assemblage des synapses", alors que les 360 gènes régulés à la hausse ont montré un enrichissement significatif pour les gènes liés au «processus métabolique des acides aminés cellulaires» et au «transport» (Fig. 1e). L'analyse SynGO a révélé que les gènes régulés négativement dans les neurones Chd8 CKO étaient enrichis en gènes liés à la fonction pré- et post-synaptique, alors que les gènes régulés positivement ne présentaient aucun enrichissement significatif (Fig. 1f, Fig. 2 supplémentaire). De plus, l'analyse de l'enrichissement de l'ensemble de gènes (GSEA) pour les voies de l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) a montré que les gènes ribosomiques étaient significativement régulés à la baisse dans les neurones Chd8 CKO (Fig. 1g).

a Représentation schématique de la procédure expérimentale de culture de neurones primaires, suppression de Chd8 par recombinaison médiée par Cre et dépolarisation neuronale induite par KCl (voir Méthodes pour plus de détails). La tétrodotoxine (TTX) et l'antagoniste des récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA) D-AP5 ont été ajoutés aux neurones afin de réduire l'activité neuronale avant la dépolarisation induite par le KCl. b Analyse par transcription inverse (RT) et réaction en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel de l'ARNm de Chd8 dans les neurones témoins et Chd8 CKO traités avec 5 ou 55 mM de KCl. Les données sont des moyennes ± sem (n = 3 souris de chaque génotype). **P < 0,01, ****P < 0,0001 (ANOVA unidirectionnelle avec test post hoc de Tukey). c Micrographies à contraste de phase de neurones primaires cultivés pendant 10 jours. Barres d'échelle, 50 µm. d Parcelle volcanique pour les gènes exprimés de manière différentielle dans les neurones Chd8 CKO par rapport aux neurones témoins sous la condition de KCl 5 mM, tel que déterminé par analyse ARN-seq (n = 3 souris de chaque génotype, 1 mâle et 2 femelles pour les souris Chd8 CKO et 2 mâles et 1 femelle pour les souris témoins). Les gènes différentiellement exprimés (valeur P ajustée au FDR de <0,05) sont surlignés en rouge. e Analyse GO de gènes dont l'expression a été régulée positivement (360 gènes) ou régulée négativement (509 gènes) dans les neurones Chd8 CKO. f Analyse SynGO des gènes dont l'expression était régulée négativement (509 gènes) dans les neurones Chd8 CKO. g GSEA pour les voies KEGG dans les neurones Chd8 CKO par rapport aux neurones témoins dans la condition KCl 5 mM. NES, score d'enrichissement normalisé.

La dépolarisation neuronale médiée par une augmentation de la concentration extracellulaire en KCl induit l'expression de gènes dépendants de l'activité23. Nous avons donc ensuite examiné si l'induction de l'expression génique en réponse à l'activité neuronale est altérée par l'ablation de Chd8 dans des neurones postmitotiques en culture. Les neurones témoins traités avec du KCl 55 mM pendant 2 h ont montré une augmentation significative de l'expression de gènes dépendants de l'activité tels que Arc, Egr1, Fos, Fosb, Npas4 et Nr4a1 par rapport à ceux traités avec du KCl 5 mM (Fig. 2a, Supplémentaire Tableau 2). L'abondance maximale d'ARNm s'est produite à environ 1 h pour Egr1 et à environ 2 h pour Fosb et Nr4a1, les quantités de ces ARNm diminuant progressivement par la suite (Fig. 3a – c supplémentaires). Pour les neurones traités avec du KCl 55 mM, l'expression de 775 gènes a été régulée à la baisse et celle de 404 gènes a été régulée à la hausse par l'ablation de Chd8 (P ajusté au FDR <0, 05) (Fig. 2b, tableau supplémentaire 3). Parmi ces gènes exprimés de manière différentielle, l'expression de gènes dépendants de l'activité, notamment Egr1, Fosb et Nr4a1, était significativement régulée à la baisse dans les neurones Chd8 CKO (Fig. 2b, c). L'analyse par immunotransfert a confirmé que l'expression dépendante de l'activité de FOSB au niveau des protéines était significativement atténuée dans les neurones Chd8 CKO par rapport aux neurones témoins (Fig. 3d – f supplémentaires). Nous avons également examiné nos données d'ARN-seq pour les 190 gènes induits par KCl avec un log2 (variation de facteur) de> 2,0 associé à une valeur P ajustée au FDR de <0,01 dans les neurones témoins traités avec 55 mM de KCl par rapport à ceux traités avec 5 mM KCl (figure 2a). La GSEA a révélé que l'expression de ces gènes induits par le KCl était régulée à la baisse dans Chd8 CKO par rapport aux neurones témoins dans la condition de KCl à 55 mM (Fig. 2d). De plus, l'analyse SynGO et la GSEA pour les voies KEGG ont révélé que les gènes dont l'expression était significativement régulée à la baisse dans les neurones Chd8 CKO par rapport aux neurones témoins dans cette condition comprenaient ceux liés aux synapses et aux ribosomes (Fig. 4a – c supplémentaires). La comparaison des gènes exprimés de manière différentielle (P ajusté par FDR <0, 05) entre Chd8 CKO et les neurones témoins dans les conditions de KCl 5 et 55 mM a montré que 227 gènes régulés positivement et 426 gènes régulés négativement étaient spécifiquement identifiés par un traitement KCl 55 mM (Fig. 2e, Fig. 4d–f, tableau supplémentaire 4). L'analyse GO a révélé que ces gènes régulés à la baisse étaient enrichis en gènes liés à la "transcription, sur modèle d'ADN", au "traitement de l'ARNm", au "développement du système nerveux" et à la "réponse cellulaire à l'ion calcium" (Fig. 2f).

un diagramme Volcano pour les gènes exprimés de manière différentielle dans les neurones isolés de souris témoins et traités avec 55 mM de KCl contre 5 mM de KCl (n = 3 souris par condition). Les gènes différentiellement exprimés (valeur P ajustée au FDR de <0,05) sont surlignés en rouge. b Volcano plot pour les gènes différentiellement exprimés dans les neurones Chd8 CKO par rapport aux neurones témoins dans la condition KCl 55 mM (n = 3 souris de chaque génotype, 1 mâle et 2 femelles pour les souris Chd8 CKO et 2 mâles et 1 femelle pour les souris témoins). Les gènes différentiellement exprimés (valeur P ajustée au FDR de <0,05) sont surlignés en rouge. c Carte thermique représentant l'expression des gènes dépendants de l'activité dans Chd8 CKO et les neurones témoins dans les conditions de KCl 5 et 55 mM (n = 3 souris pour chaque condition). Les gènes différentiellement exprimés dans les neurones Chd8 CKO par rapport aux neurones témoins sous la condition de KCl 55 mM sont indiqués par des astérisques. d Graphique GSEA des gènes exprimés de manière différentielle parmi les gènes induits par le KCl (gènes régulés positivement avec un log2 (changement de facteur) de> 2 associé à une valeur P ajustée au FDR de <0, 01 dans les neurones de souris témoins traitées avec du KCl 55 mM par rapport à ceux traités avec 5 mM de KCl en a) pour les neurones Chd8 CKO par rapport aux neurones témoins dans la condition de 55 mM de KCl. NES, score d'enrichissement normalisé. e Diagrammes de Venn montrant le chevauchement entre les gènes dont l'expression était régulée positivement ou négativement dans les neurones Chd8 CKO par rapport aux neurones témoins dans les conditions de KCl 5 et 55 mM. f Analyse GO de gènes dont l'expression était spécifiquement régulée à la hausse (227 gènes) ou à la baisse (426 gènes) dans les neurones Chd8 CKO traités avec du KCl 55 mM comme indiqué dans e. Les niveaux de signification pour les valeurs de P et FDR q sont indiqués par * pour <0,05, ** pour <0,01, *** pour <0,001 et **** pour <0,0001.

Compte tenu du rôle de CHD8 en tant que facteur de remodelage de la chromatine, nous avons effectué un test d'analyse de la chromatine accessible à la transposase (ATAC) -seq pour évaluer l'accessibilité de la chromatine à l'échelle du génome dans Chd8 CKO et contrôler les neurones après traitement avec 5 ou 55 mM KCl pendant 2 h . La plupart des pics ATAC-seq (50, 2 à 78, 2% des pics totaux) étaient partagés entre ces quatre conditions (Fig. 3a). La carte thermique et les profils de densité autour des pics d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)-seq CHD8 de haute confiance des données précédemment publiées12 ont révélé des schémas de distribution similaires de l'intensité du signal ATAC-seq entre Chd8 CKO et les neurones témoins (Fig. 3b, Fig. 5a supplémentaire). Nous avons également examiné l'accessibilité de la chromatine aux loci de plusieurs gènes dépendants de l'activité, notamment Fosb, Nr4a1, Homer1 et Egr3, qui étaient tous régulés à la baisse dans les neurones CKO Chd8 par rapport aux neurones témoins sous la condition KCl 55 mM. Des pics de CHD8 qui chevauchaient des sites de chromatine accessibles ont été détectés au niveau ou à proximité de ces locus génomiques (Fig. 3c). Bien que l'intensité du signal de plusieurs pics ATAC-seq dans ces régions ait augmenté en réponse à l'activité neuronale, les schémas de distribution du signal étaient similaires pour les deux génotypes (Fig. 3c, Fig. 5b supplémentaire). En outre, nous avons effectué une analyse ChIP-quantitative polymerase chain reaction (qPCR) pour examiner les effets de la suppression de Chd8 sur la Lys4 triméthylée de l'abondance de l'histone H3 (H3K4me3) et le recrutement de l'ARN polymérase II. L'étendue de l'enrichissement en H3K4me3 ou en ARN polymérase II autour du site de début de transcription (TSS) de plusieurs gènes dépendants de l'activité avait tendance à être plus élevée dans les neurones Chd8 CKO que dans les neurones témoins sous la condition de KCl 55 mM, mais ces différences n'ont pas atteint la signification statistique (Fig. 3d, e).

un diagramme de Venn montrant le chevauchement entre les pics ATAC-seq détectés dans Chd8 CKO ou des neurones témoins isolés de souris mâles et exposés à 5 ou 55 mM de KCl (n = 2 souris par condition). Les données fusionnées pour deux répliques ATAC-seq indépendantes pour chaque condition ont été utilisées pour l'analyse. Les résultats séparés des deux réplicats pour chaque condition sont présentés dans la Fig. 5 supplémentaire. b Regroupement de la densité du signal et des cartes thermiques des pics ATAC-seq dans la région s'étendant de 3 kb en amont à 3 kb en aval du centre des pics de liaison CHD8. Les données CHD8 ChIP-seq proviennent d'une étude précédente12. c Données ATAC-seq, CHD8 ChIP-seq et RNA-seq pour les gènes représentatifs dépendant de l'activité visualisés dans le navigateur Integrative Genomics Viewer. Les zones ombrées en jaune indiquent des pics ATAC-seq et ChIP-seq qui se chevauchent. d, e Une analyse ChIP-qPCR a été réalisée pour le dépôt de H3K4me3 (d) et la liaison de l'ARN polymérase II (e) dans la région TSS des gènes dépendants de l'activité indiqués (ou dans la région en amont de Homer1 examinée comme contrôle négatif) dans l'hippocampe neurones isolés de Chd8 CKO ou de souris témoins et traités avec du KCl 55 mM pendant 2,0 h. La puce a été réalisée avec de l'immunoglobuline G normale (IgG) comme contrôle des anticorps anti-H3K4me3 ou anti-ARN polymérase II. Les données sont des moyennes ± sem (n = 3 expériences indépendantes). Les valeurs P ont été déterminées avec le test t de Student non apparié.

Nous avons ensuite généré des souris présentant un déficit en CHD8 à l'âge adulte (ci-après appelées souris Chd8 CKO) en administrant du tamoxifène à des souris CAG-CreER/Chd8F/F âgées de 8 à 12 semaines par voie intrapéritonéale pendant cinq jours consécutifs. Nous avons confirmé que les allèles floxés (F) de Chd8 étaient efficacement supprimés dans l'hippocampe de souris Chd8 CKO, comme en témoigne la perte d'expression de Chd8 aux niveaux de l'ARNm et des protéines (Fig. 4a, Fig. 6a, b supplémentaires). Pour examiner si CHD8 régule l'expression de gènes dépendants de l'activité in vivo, nous avons induit une activité neuronale généralisée dans le cerveau de Chd8 CKO et des souris témoins par injection de l'agoniste des récepteurs du glutamate KA. Bien que nous n'ayons pas détecté de différence significative dans la gravité des crises entre les souris Chd8 CKO et les souris témoins après le traitement KA (Fig. 4b), l'expression de gènes dépendants de l'activité, notamment Fosb, Nr4a1 et Egr1 dans l'hippocampe, était significativement régulée à la baisse chez les souris Chd8 CKO. par rapport aux souris témoins avec un stade de crise similaire à 60 min après le traitement KA (Fig. 4c). L'abondance de la protéine FOSB a également été significativement réduite dans l'hippocampe des souris Chd8 CKO par rapport à celle des souris témoins après traitement KA (Fig. 6a, c supplémentaires). Pour examiner si l'ablation de Chd8 modifie l'accessibilité de la chromatine in vivo, nous avons effectué une analyse ATAC-seq pour l'hippocampe de Chd8 CKO et des souris témoins après traitement par véhicule ou de celles présentant un stade de crise similaire 60 min après traitement KA. La plupart des pics ATAC-seq (51, 6 à 74, 0% des pics totaux) étaient partagés entre ces quatre conditions (Fig. 4d). La carte thermique et les profils de densité autour des pics CHD8 ChIP-seq de haute confiance ont révélé une légère diminution de l'intensité du signal ATAC-seq dans l'hippocampe des souris Chd8 CKO par rapport à celle des souris témoins après traitement KA ou véhicule (Fig. 4e, Fig. 7a). L'accessibilité de la chromatine au niveau du corps du gène de plusieurs gènes dépendants de l'activité, notamment Fosb, Nr4a1 et Egr1, a été augmentée par le traitement KA dans l'hippocampe témoin et Chd8 CKO (Fig. 4f, Fig. 7b supplémentaire). De plus, l'intensité du signal ATAC-seq au niveau de ces locus était diminuée dans l'hippocampe des souris Chd8 CKO par rapport à celle des souris témoins après traitement KA (Fig. 4f, Fig. 7b supplémentaire). Ces résultats indiquent donc que CHD8 est essentiel pour la transcription et l'accessibilité de la chromatine aux gènes dépendants de l'activité dans les neurones activés in vivo.

une analyse RT-qPCR de l'ARNm de Chd8 dans l'hippocampe de souris mâles CAG-CreER/Chd8F/F (Chd8 CKO) et Chd8F/F (témoin) âgées de 17 à 18 semaines après un traitement au tamoxifène pendant cinq jours consécutifs à 8 à 12 semaines d'âge (n = 6 souris de chaque génotype). b Évolution temporelle du score de crise pendant 60 min après l'injection de KA chez des souris mâles Chd8 CKO (n = 12) et témoin (n = 14) âgées de 16 à 18 semaines (panneau de gauche) ou Chd8 CKO (n = 18) et témoin (n = 16) souris femelles âgées de 13 à 18 semaines (panneau de droite). c Analyse par RT-qPCR de l'abondance de l'ARNm pour les gènes dépendants de l'activité indiqués dans l'hippocampe de souris Chd8 CKO traitées avec le véhicule (n = 6), de souris témoins traitées avec le véhicule (n = 6), de souris Chd8 CKO traitées avec KA (n = 9) et des souris témoins traitées avec KA (n = 7) à l'âge de 16 à 18 semaines. Des souris mâles avec un stade de crise de 3 à 5 ont été étudiées pour cette analyse. Les données sont des moyennes ± sem d diagramme de Venn montrant le chevauchement entre les pics ATAC-seq détectés dans l'hippocampe de Chd8 CKO et les souris témoins avec un stade de crise similaire à 60 min après le traitement KA ou véhicule (n = 2 souris par condition : 1 mâle et 1 femelle pour Chd8 CKO et souris témoins traitées avec KA, 2 mâles pour Chd8 CKO et souris témoins traitées avec véhicule). Les données fusionnées pour deux répliques ATAC-seq indépendantes pour chaque condition ont été utilisées pour l'analyse. Les résultats séparés pour les deux réplicats de chaque condition sont présentés dans la Fig. 7 supplémentaire. f Signaux ATAC-seq de gènes dépendants de l'activité représentatifs visualisés dans le navigateur Integrative Genomics Viewer. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 (test t de Student non apparié en (a), ANOVA répétée à deux facteurs en (b) et ANOVA à un facteur avec le test post hoc de Tukey en (c)).

Étant donné que la dérégulation de l'expression génique dépendante de l'activité est associée à la formation de la mémoire et à des troubles psychiatriques5,6, nous avons effectué plusieurs tests comportementaux avec Chd8 CKO et des souris mâles et femelles témoins. Dans le test du labyrinthe aquatique de Morris, les essais de plate-forme visible et cachée sur cinq jours consécutifs ont révélé que la latence d'échappement était similaire chez les souris Chd8 CKO et témoins (Fig. 5a). Après une formation sur les essais de plate-forme visible et cachée, nous avons effectué un essai de sonde dans lequel la plate-forme cachée a été retirée du labyrinthe aquatique. Le nombre de croisements de plates-formes cibles ne différait pas entre Chd8 CKO et les souris mâles ou femelles témoins (Fig. 5b). Le temps passé dans le quadrant cible a été significativement augmenté par rapport à celui de chacun des autres quadrants pour les souris Chd8 CKO et témoins (Fig. 5c), ce qui suggère un apprentissage et une formation de mémoire normaux chez les souris Chd8 CKO.

a Latence pour atteindre les plates-formes visibles et cachées dans le test du labyrinthe aquatique de Morris pour Chd8 CKO (n = 18) et contrôle (n = 20) souris mâles âgées de 11 à 15 semaines (panneau de gauche) ou pour Chd8 CKO (n = 16) et contrôle (n = 18) souris femelles entre 11 et 16 semaines d'âge (panneau de droite). Les données sont moyennes ± sem b, c Nombre de croisements cibles (b) et temps passé dans chaque quadrant (c) après le retrait de la plate-forme au jour 6 pour l'essai de sonde du test du labyrinthe d'eau de Morris effectué avec les souris en (a). T, O, L et R représentent respectivement les quadrants cible, opposé, gauche et droit. Le cercle gris représente la plateforme cible. Les données sont présentées sous forme de diagrammes en boîte et moustaches, dans lesquels les bords inférieur et supérieur de la boîte indiquent respectivement les 25e et 75e centiles, la barre centrale indique la médiane et les moustaches indiquent les extrêmes non aberrants. **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 (ANOVA répétée à deux facteurs (a), ANOVA factorielle à deux facteurs (b) ou ANOVA à un facteur avec le test post hoc de Tukey ( c)).

Nous avons ensuite examiné le comportement anxieux et le comportement social anormal typiques des souris modèles TSA, y compris les souris insuffisantes en haplo CHD812,13,14,15. La distance totale parcourue dans le test en champ libre ne différait pas entre les génotypes, ce qui suggère une activité locomotrice normale chez les souris Chd8 CKO (Fig. 6a). Alors que le temps passé au centre du champ ouvert était réduit pour les souris mâles Chd8 CKO par rapport aux souris témoins, celui des souris femelles Chd8 CKO était similaire à celui des souris témoins (Fig. 6b). Nous n'avons pas détecté de différence entre les génotypes pour le temps passé dans les bras ouverts lors du test du labyrinthe en plus surélevé ou pour celui passé dans la salle lumineuse lors du test de transition clair-obscur (Fig. 6c, d). Les souris mâles et femelles Chd8 CKO ont également montré un comportement d'auto-toilettage normal (Fig. 6e). Les souris Chd8 CKO femelles, mais pas mâles, ont montré une augmentation du temps de contact total pendant le test d'interaction sociale réciproque (Fig. 6f). Le nombre de contacts sociaux au cours de ce test ne différait pas entre Chd8 CKO et les souris témoins (Fig. 6g). Dans le test de sociabilité à trois chambres, Chd8 CKO et les animaux témoins ont montré une préférence significative pour une nouvelle souris (étranger 1) (Fig. 6h, i). Dans le test de préférence de nouveauté sociale, les souris Chd8 CKO et les souris mâles témoins ont également montré une préférence significative pour une nouvelle souris (étranger 2) par rapport à une souris familière (étranger 1), alors que les souris femelles de l'un ou l'autre génotype n'ont pas montré une telle préférence ( Fig. 6j, k). Ces résultats suggèrent donc que l'ablation de Chd8 dans le cerveau adulte a des effets sélectifs sur les caractéristiques comportementales.

a, b Distance totale parcourue (a) et temps passé dans la zone centrale (b) pour le test en plein champ réalisé avec Chd8 CKO (n = 18) et contrôle (n = 20) souris mâles âgées de 14 à 16 semaines ou avec Chd8 CKO (n = 16) et contrôle (n = 18) souris femelles entre 12 et 17 semaines d'âge. c Temps passé dans les bras ouverts pour le test du labyrinthe surélevé effectué avec Chd8 CKO (n = 18) et contrôle (n = 20) souris mâles âgées de 15 à 17 semaines ou avec Chd8 CKO (n = 16) et contrôle (n = 18) souris femelles âgées de 12 à 17 semaines. d Temps passé dans la chambre lumineuse pour le test de transition clair-obscur réalisé avec Chd8 CKO (n = 18) et contrôle (n = 20) souris mâles âgées de 14 à 17 semaines ou avec Chd8 CKO (n = 16) et contrôle (n = 18) souris femelles âgées de 12 à 17 semaines. e Durée totale du toilettage pendant une période de 10 min pour Chd8 CKO (n = 16) et contrôle (n = 17) souris mâles entre 11 et 16 semaines d'âge ou pour Chd8 CKO (n = 16) et contrôle (n = 18) souris femelles âgées de 13 à 18 semaines. f, g Durée totale des contacts (f) et nombre de contacts (g) pour le test d'interaction sociale dans un nouvel environnement réalisé avec Chd8 CKO (n = 9) et contrôle (n = 10) souris mâles à 15 à 17 semaines d'âge ou avec Chd8 CKO (n = 7) et contrôle (n = 9) souris femelles entre 12 et 17 semaines d'âge. h, i Traces représentatives pour les souris mâles (h) et temps passé autour de chaque cage (i) pour le test de sociabilité à trois chambres effectué avec Chd8 CKO (n = 18) et contrôle (n = 20) souris mâles à 16 à 18 semaines d'âge ou avec Chd8 CKO (n = 16) et contrôle (n = 18) souris femelles entre 13 et 17 semaines d'âge. Barres d'échelle, 5 cm. j, k Traces représentatives pour les souris mâles (j) et le temps passé autour de chaque cage (k) pour le test de préférence de nouveauté sociale à trois chambres effectué avec les souris en h et i. Barres d'échelle, 5 cm. Les données sont présentées sous forme de boîtes à moustaches, dans lesquelles les bords inférieur et supérieur de la boîte indiquent les 25e et 75e centiles, respectivement, la barre centrale indique la médiane et les moustaches indiquent les extrêmes non aberrants (a–g, i, k). *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,0001 (ANOVA factorielle bidirectionnelle avec test post hoc de Tukey (a–g) ou test t de Student apparié (i, k)).

Nous avons montré ici que la délétion homozygote de Chd8 dans les neurones postmitotiques de souris altère l'expression des gènes dépendants de l'activité. Nous avons également constaté que l'expression de Chd8 dans le cerveau adulte n'est pas essentielle pour la susceptibilité aux crises ou pour la formation de la mémoire dans le test du labyrinthe aquatique de Morris, mais est nécessaire pour la transcription des gènes dépendants de l'activité associés aux crises induites par KA. Nos données fournissent ainsi un aperçu du rôle de CHD8 dans les réponses transcriptionnelles dépendantes de l'activité dans les neurones postmitotiques.

Il a déjà été démontré que CHD8 régule la prolifération et la différenciation de nombreux types de cellules souches et précurseurs par le contrôle transcriptionnel18,19,20,21,24,25,26. Bien que l'expression de Chd8 persiste dans le cerveau adulte27, le rôle fonctionnel de CHD8 dans les neurones postmitotiques n'est pas clair. Nos résultats montrent maintenant que CHD8 contribue à la régulation transcriptionnelle en réponse à l'activité neuronale. L'expression génique dépendante de l'activité intervient dans le développement synaptique et la plasticité sous-jacente à l'apprentissage et à la mémoire6, et sa perturbation est liée à des troubles neuropsychiatriques tels que les TSA5. Alors que nous avons détecté des anomalies comportementales sélectives, notamment un comportement de type anxiété accru dans le test en champ libre chez les souris mâles Chd8 CKO et un comportement social anormal chez les souris femelles Chd8 CKO dans cette étude, les souris knock-out hétérozygotes Chd8 manifestent des altérations de la transmission synaptique, comportementaux de type TSA phénotypes et déficits d'apprentissage et de mémoire12,13,14,15,28. Nos observations suggèrent donc qu'une régulation transcriptionnelle dépendante de l'activité défectueuse par CHD8 peut contribuer aux phénotypes neurologiques des individus atteints de TSA associés à des mutations de CHD8. En plus des changements dans l'expression des gènes dépendants de l'activité, nous avons constaté que les gènes liés à la traduction étaient fortement enrichis parmi les gènes régulés négativement dans les neurones Chd8 CKO. La traduction locale dans les neurones fournit des protéines aux axones et aux synapses nécessaires à la plasticité synaptique et à la fonction neuronale29. La dérégulation de la traduction a déjà été impliquée dans les phénotypes de type ASD30. CHD8 contribue ainsi à la régulation transcriptionnelle liée à de multiples processus, notamment la transcription, la traduction et le développement du système nerveux, et une régulation défectueuse de ces processus associée à la mutation CHD8 pourrait sous-tendre la pathogenèse des TSA.

L'activité neuronale modifie dynamiquement le paysage de la chromatine accessible en association avec l'expression génique dépendante de l'activité dans le cerveau adulte31. En revanche, notre analyse ATAC-seq n'a révélé que de petits changements dans l'accessibilité de la chromatine dans les neurones en culture exposés à une concentration extracellulaire élevée de KCl, similaire aux résultats précédents32. Ces différences dans les effets de l'activité neuronale sur l'accessibilité de la chromatine peuvent être dues à des différences de conditions expérimentales entre les neurones in vivo et ceux en culture. En effet, notre analyse ATAC-seq de l'hippocampe de souris traitées au KA a révélé une augmentation de l'accessibilité de la chromatine au niveau du corps génique des gènes dépendants de l'activité. Conformément aux découvertes précédentes selon lesquelles CHD8 favorise l'adoption de structures de chromatine ouvertes dans plusieurs types de cellules19,20,33, nous avons constaté que l'ablation de Chd8 dans le cerveau adulte réduisait l'accessibilité de la chromatine aux loci des gènes dépendants de l'activité. Bien que nous n'ayons pas détecté de changements d'accessibilité de la chromatine en réponse à la suppression de Chd8 in vitro, probablement en raison de limitations techniques, il est possible que CHD8 affecte également dans une certaine mesure l'accessibilité de la chromatine dans les neurones en culture, une possibilité qui mérite une enquête plus approfondie. Étant donné que CHD8 se lie à la région promotrice des gènes dépendants de l'activité, il peut favoriser l'accessibilité de la chromatine au niveau des éléments régulateurs de ces gènes et ainsi faciliter leur transcription dépendante de l'activité. D'autres études seront nécessaires pour clarifier les mécanismes détaillés de la régulation transcriptionnelle par CHD8.

L'haploinsuffisance CHD8 est un facteur de risque hautement pénétrant pour le TSA, et la mutation hétérozygote Chd8 confère des phénotypes comportementaux de type TSA chez la souris7,12,13,14,15,16,17. Certaines personnes atteintes de TSA associées à la mutation CHD8 ont des crises d'épilepsie7, alors que nous n'avons pas détecté de changement dans la sensibilité aux crises chez les souris Chd8 CKO. Un comportement social anormal, tel qu'un temps de contact total accru pendant le test d'interaction sociale réciproque, est l'une des caractéristiques comportementales reproductibles des souris mutantes Chd812,13,16,17,21. Les souris Chd8 CKO femelles, mais pas mâles, dans la présente étude ont montré un comportement social altéré, suggérant un phénotype sexuellement dimorphique15. De plus, les souris mâles Chd8 CKO ont manifesté un comportement de type anxiété accru dans le test en champ ouvert, mais pas dans le test du labyrinthe en plus élevé et le test de transition clair-foncé. L'anxiété est l'un des symptômes des personnes atteintes de TSA1,7 et les souris mutantes hétérozygotes Chd8 manifestent également un comportement de type anxieux12,13. Nos résultats suggèrent que CHD8 dans le cerveau adulte peut contribuer au contrôle du comportement social et du comportement anxieux.

Des phénotypes comportementaux sexuellement dimorphes ont déjà été observés chez des souris modèles TSA, y compris des souris mutantes Chd815. Étant donné que les hormones sexuelles et les chromosomes sexuels sont impliqués dans les différences de comportement entre les sexes34, il est possible que la suppression de Chd8 modifie les niveaux d'hormones sexuelles ou l'expression de leurs récepteurs. Les antécédents génétiques, l'âge et les différences de mutation peuvent également influencer les résultats comportementaux liés au dimorphisme sexuel35,36.

Nous avons utilisé la lignée de souris CAG-CreER pour obtenir une délétion de Chd8 inductible par le tamoxifène dans des neurones postmitotiques de souris in vitro et dans le cerveau adulte in vivo. Étant donné que cette lignée entraîne la recombinaison dans tous les types de cellules, plutôt que de montrer une spécificité de type cellulaire, la suppression de Chd8 non seulement dans les neurones postmitotiques, mais aussi dans les cellules gliales et d'autres populations cellulaires pourrait influencer les changements transcriptomiques, épigénétiques et comportementaux observés dans cette étude. D'autres études sont justifiées pour déterminer si ces changements sont attribuables à des altérations des neurones postmitotiques.

Il a déjà été démontré que CHD8 avait des rôles sensibles au dosage dans la régulation transcriptionnelle et les phénotypes comportementaux33,37. Étant donné que la suppression homozygote de Chd8 dans le cerveau adulte a entraîné des altérations de la transcription et certains déficits comportementaux dans la présente étude, il est également possible que la mutation hétérozygote de Chd8 puisse conférer des effets similaires mais moins prononcés. Collectivement, les présents résultats révèlent un rôle pour CHD8 dans la régulation transcriptionnelle dépendante de l'activité dans les neurones postmitotiques et le cerveau adulte, et ils fournissent donc un aperçu potentiellement important des mécanismes moléculaires sous-jacents à la pathogenèse des TSA.

La génération de souris Chd8F/F a été décrite précédemment12. Des souris Chd8F/F ont été croisées avec des souris hétérozygotes CAG-CreER pour produire des souris CAG-CreER/Chd8F/F24. Pour l'induction de la recombinaison médiée par Cre in vivo, des souris CAG-CreER/Chd8F/F âgées de 8 à 12 semaines ont reçu une injection intrapéritonéale pendant cinq jours consécutifs de tamoxifène (2 mg par souris) dissous dans de l'huile de maïs. Un traitement multiple au tamoxifène entraîne une suppression plus efficace des allèles floxés par rapport à un traitement unique38. Les souris ont été génotypées par analyse PCR de l'ADN génomique avec des amorces pour Chd8 (5′-CCCAAAAGACCAAATCAAAACAAAC-3′, 5′-CCATAGGCTGAAGAACCGTAATTG-3′ et 5′-AGGCTTAGAAACCCGTCGAG-3′) et Cre (5′-AGGTTCGTTCACTCATGGA-3 ' et 5'-TCGACCAGTTTAGTTACCC-3'). Toutes les expériences ont été approuvées par le Comité d'éthique animale de l'Université de Kanazawa.

Les neurones primaires ont été isolés de l'hippocampe de souris mâles et femelles à E18.5 comme décrit précédemment, mais avec des modifications mineures23,39. La génération de neurones pyramidaux est presque complète à ce stade, et l'isolement des neurones du tissu embryonnaire présente les avantages que le tissu est plus facilement dissocié et que la contamination par les cellules gliales et les fibroblastes est minimisée. En bref, le tissu a été incubé pendant 20 min à 37 ° C avec 0,25% de trypsine-EDTA et DNase (047-26771, Wako) à 25 µg / ml, et il a été soumis à une dissociation douce par passage répété à travers une pipette Pasteur après l'ajout de milieu de Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal et de DNase (10 µg/ml). Les cellules dissociées ont été passées à travers un tamis cellulaire de 40 μm, collectées par centrifugation et transférées sur une plaque recouverte de poly-d-lysine (P6407, Sigma-Aldrich) pour culture à 37 ° C dans un milieu neurobasal additionné de MACS NeuroBrew-21 supplément (130-097-263, Miltenyi Biotec) à 20 ml/l, L-glutamine 2 mM (25030081, Thermo Fisher Scientific) et pénicilline-streptomycine (15140122, Thermo Fisher Scientific) à 10 ml/l. Après 2 jours in vitro (DIV), les cultures ont été traitées avec 1 µM d'Ara-C pendant 24 h pour éliminer toutes les cellules en division. Pour l'induction de la recombinaison médiée par Cre in vitro, les neurones ont été incubés pendant 24 h en présence de 4-OHT 500 µM à 4 DIV. Pour la dépolarisation neuronale induite par le KCl, 1 µM de tétrodotoxine (Wako) et 100 µM de D-AP5 (Tocris Bioscience) ont été ajoutés au milieu de culture à 9 DIV pour réduire l'activité neuronale et les neurones ont ensuite été traités avec 5 ou 55 mM de KCl pendant 2 h en ajoutant un tampon de contrôle (5 mM KCl, 165 mM NaCl, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2, 11 mM HEPES) ou un tampon de dépolarisation (170 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2, 11 mM HEPES) à une dilution finale de 32,4 % à 10 DIV.

Des anticorps polyclonaux de lapin anti-CHD8 ont été générés en interne et utilisés pour l'analyse par immunotransfert. D'autres anticorps comprenaient ceux contre TUBB3 (ab78078, Abcam, 1:500), contre GFAP (IR524, DAKO, 1:500) et contre Olig2 (AB9610, Millipore, 1:500) pour la coloration par immunofluorescence, ceux contre FOSB (ab184938, Abcam, 1:2000) et à HSP90 (610419, BD Biosciences, 1:2000) pour l'analyse par immunotransfert, et ceux à H3K4me3 (ab8580, Abcam, 2 µg par échantillon) et à l'ARN polymérase II (91151, Active Motif, 2 µg par échantillon) pour ChIP.

La coloration par immunofluorescence a été réalisée comme décrit précédemment21. Les cellules cultivées ont été fixées pendant une nuit à 4 ° C avec 4 % de paraformaldéhyde dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), exposées à 2 % d'albumine de sérum bovin et 0,3 % de Triton X-100 dans du PBS, puis incubées pendant une nuit à 4 ° C avec du primaire. anticorps. Les complexes immuns ont été détectés avec des anticorps secondaires de chèvre conjugués à Alexa Fluor 488 ou Alexa Fluor 546 (Thermo Fisher Scientific). Le test TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling) a été réalisé à l'aide d'un MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct (8445, MBL). Toutes les cellules ont été contre-colorées avec du 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et les images ont été acquises avec un microscope BZ-X800 (Keyence). Le logiciel ImageJ a été appliqué pour compter le nombre de chaque type de cellule ou de cellules apoptotiques.

L'ARN total (500 ng) isolé à partir de neurones en culture ou de l'hippocampe à l'aide du réactif TRIzol (Thermo Fisher Scientific) a été soumis à une RT avec le mélange ReverTra Ace RT avec un dissolvant d'ADNg (Toyobo). L'ADNc résultant a été soumis à une analyse par PCR en temps réel avec l'utilisation de Luna Universal qPCR Master Mix (M3003, New England Biolabs) et d'amorces spécifiques dans un Thermal Cycler Dice Real Time System III (Takara Bio). Les données ont été normalisées par l'abondance d'ARNm Rplp0 ou Gapdh. Les amorces PCR (respectivement sens et antisens) étaient les suivantes : Rplp0, 5'-GGACCCGAGAAGACCTCCTT-3' et 5'-GCACATCACTCAGAATTTCAATGG-3' ; Gapdh, 5'-GCCTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3' et 5'-GAGTGGGAGTTGCTGTTGAAGTCG-3'; Chd8L, 5'-TCCCTTTTTGGTCATTGCTC-3' et 5'-TTCAGCCTATGGGCTTCATC-3'; Fosb, 5′-TTTTCCGGAGACTACGACTC-3′ et 5′-GTGATTGCGGTGACCGTTG-3′; Nr4a1, 5'-TTGAGTTCGGCAAGCCTACC-3' et 5'-GTGTACCCGTCCATGAAGGTG-3'; et Egr1, 5'-TCGGCTCCTTTCCCTCACTCA-3' et 5'-CTCATAGGGTTGTTCGCTCGG-3'.

Des extraits protéiques totaux ont été préparés à partir de neurones cultivés ou de l'hippocampe et soumis à une analyse par immunoblot comme décrit précédemment40. Le logiciel ImageJ a été appliqué pour mesurer l'intensité du signal pour chaque protéine.

L'ARN total a été extrait des neurones traités avec du KCl 5 ou 55 mM à l'aide du réactif TRIzol. L'ARN messager (1 μg) purifié à partir de l'ARN total à l'aide d'un module d'isolation magnétique d'ARNm NEBNext Poly (A) (New England Biolabs) a été utilisé pour préparer une bibliothèque d'ADNc à l'aide d'un kit de préparation de bibliothèque d'ARN directionnel NEBNext Ultra II pour Illumina (New England Biolabs), et chaque bibliothèque a ensuite été séquencée à l'aide d'un système NovaSeq 6000 (Illumina). La qualité des données de séquençage brutes a été vérifiée avec FastQC (version 0.11.9) et le rognage des séquences d'adaptation a été effectué avec Trimmomatic (version 0.39)41. La quantité totale de chaque ARNm a été calculée à l'aide d'une série de programmes comprenant HISAT2 (version 2.1.0)42, featureCounts (version 2.0.0)43 et DESeq2 (version 1.26.0)44. Les lectures d'ARN-seq ont été cartographiées par rapport au génome de la souris (mm10). GSEA a été réalisée comme décrit précédemment avec l'utilisation du logiciel GSEA version 4.2.145. Un ensemble de gènes dont l'expression était significativement régulée positivement (log2 (multiplication) de> 2, 0 associé à une valeur P ajustée au FDR de <0, 01) dans les neurones témoins traités avec du KCl 55 mM par rapport à ceux traités avec du KCl 5 mM a été utilisé pour GSEA . L'analyse GO des gènes différentiellement exprimés (FDR q < 0,05) a été réalisée avec l'utilisation de DAVID46 et SynGO47.

Les bibliothèques ATAC-seq ont été préparées à l'aide d'un kit ATAC-Seq (Active Motif). Chd8 CKO et les neurones témoins isolés de souris mâles ont été traités avec 5 ou 55 mM de KCl pendant 2 h, puis incubés pendant 30 min à 37 ° C dans un milieu de culture contenant de la DNase (15 µg/ml). Les neurones ont ensuite été dissociés de la plaque de culture par exposition à 0,25 % de trypsine-EDTA. L'hippocampe a été manuellement dissocié du cerveau de souris de chaque génotype avec un stade de crise similaire à 60 min après le traitement par KA ou véhicule. Les noyaux ont été extraits des cellules cultivées ou de l'hippocampe à l'aide du tampon de lyse ATAC, et 1 × 105 noyaux ont été utilisés pour préparer chaque bibliothèque ATAC-seq. Les bibliothèques ont été séquencées à l'aide d'un système HiSeq 2500 (Illumina). Les lectures ont été mappées de manière unique sur le génome de la souris (mm10) à l'aide du logiciel Bowtie (version 2.2.3)48, et les lectures en double ont été supprimées avec samtools (version 1.9)49. Les fichiers BAM pour deux répliques pour chaque condition ont été fusionnés avec samtools. Des régions nettement enrichies du génome ont été identifiées à l'aide de l'appelant de pic MACS (version 2.1.1, avec l'option "-p 1e−5 --gsize mm --nomodel --extsize 160")50. La carte thermique et les profils de densité ont été générés avec plotHeatmap dans deepTools (3.5.0)51.

La puce a été réalisée essentiellement comme décrit précédemment21. Les neurones en culture traités avec du KCl 55 mM pendant 2 h ont été fixés par incubation pendant 10 min sur de la glace avec du paraformaldéhyde à 0,5 % dans du tampon ChIP (HEPES-KOH 5 mM (pH 8,0), KCl 200 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 1,5 mM, 5 % de saccharose, 0,5 % de Nonidet P-40) additionné d'un cocktail d'inhibiteurs de protéase (Wako), soumis à un traitement aux ultrasons et digéré avec une nucléase micrococcique pendant 40 min à 30 °C. Après l'ajout d'EDTA à une concentration finale de 0,1 mM, chaque échantillon digéré a été centrifugé à 15 000 × g pendant 10 min à 4 ° C, et le surnageant résultant a été incubé avec rotation pendant 6 h à 4 ° C avec des anticorps conjugués à magnétique perles. Les protéines liées ont été éluées des billes et les liaisons croisées ont été inversées par incubation pendant une nuit à 65 ° C avec 1% de SDS dans un tampon Tris-EDTA. Après avoir lavé deux fois avec du tampon ChIP et du tampon Tris-EDTA, l'ADN a été purifié à l'aide de Nucleo Spin Gel et PCR Clean-Up (Takara Bio) et soumis à une analyse PCR en temps réel comme décrit ci-dessus. Les amorces de PCR (respectivement sens et antisens) étaient les suivantes : Egr3 TSS, 5′-GGAAGGCTGGTTGGAGAC-3′ et 5′-GCACCTACCTCCCTCCAGTC-3′ ; Fosb TSS, 5′-AGCCTGGACTTTCAGGAGGT-3′ et 5′-GCTCGGGGAAGCTTAGTCTC-3′; Nr4a1 TSS, 5′-AACCTGCACTGGGGTATCAC-3′ et 5′-GACAAAGCTTGGCTTCCTTG-3′; Homer1 TSS, 5′-GCCTTTAGGAGGGGAGAAAG-3′ et 5′-GGGGAAACCACCGTTAAT-3′ ; et Homer1 en amont, 5′-TCTGCCACCTCATTTCTGCT-3′ et 5′-TAGCACACACAGGCCATCAT-3′.

Les données ChIP-seq précédemment obtenues avec des anticorps anti-CHD8 (DRA003116) ont été réanalysées comme décrit dans l'étude originale12. En bref, les lectures ont été mappées de manière unique sur le génome de la souris (mm10) à l'aide du logiciel Bowtie (version 2.2.3)48, et les lectures en double ont été supprimées avec samtools (version 1.9)49. Des régions nettement enrichies du génome ont été identifiées à l'aide de l'appelant de pic MACS (version 2.1.1, avec l'option "-p 1e−5 --gsize mm --nomodel --extsize 160")50.

Des souris mâles âgées de 16 à 18 semaines et des souris femelles âgées de 13 à 18 semaines ont reçu une injection intrapéritonéale de KA (25 mg/kg) dissous dans du PBS. L'induction de crises par KA est l'un des modèles d'épilepsie temporale les plus étudiés52. Des convulsions comportementales ont été observées pendant 1 h après l'injection et ont été notées selon les critères décrits précédemment53 : stade 0, comportement normal ; stade 1, immobilité et rigidité ; stade 2, balancement de la tête ; stade 3, clonus des membres antérieurs et élevage ; stade 4, élevage et chute continus; stade 5, crise clonique-tonique ; étape 6, la mort. L'hippocampe a ensuite été retiré, congelé instantanément dans de l'azote liquide et stocké à -80 ° C pour l'analyse de l'expression des gènes. Des souris avec un stade de crise de 3 à 5 ont été utilisées pour l'analyse de l'expression génique et l'analyse ATAC-seq.

Chd8 CKO ou des souris témoins ont été logées en groupe dans une pièce avec un cycle de 12 h de lumière, 12 h d'obscurité (lumières allumées à 8 h 00) et avec accès à la nourriture et à l'eau à volonté. Des tests comportementaux ont été réalisés sur des souris mâles et femelles âgées de 11 à 18 semaines et entre 9h00 et 18h00 comme décrit précédemment19. Chaque appareil a été nettoyé avec une solution diluée d'hypochlorite de sodium avant le test de chaque animal afin d'éviter les biais dus aux signaux olfactifs. Les tests comportementaux comprenaient le test du labyrinthe aquatique de Morris, le test en plein champ, le test de transition lumière-obscurité, le test du labyrinthe en plus surélevé, le test d'auto-toilette, le test d'interaction sociale dans un nouvel environnement et les tests de sociabilité et de préférence de nouveauté sociale. Tous les tests ont été effectués par des expérimentateurs bien formés utilisant des systèmes d'analyse automatisés comme décrit ci-dessous. Les expérimentateurs ont toujours été aveuglés au génotype de la souris afin d'exclure les biais dans les mesures comportementales.

Pour les essais sur plate-forme visible et cachée du test du labyrinthe aquatique de Morris, une piscine circulaire en plastique (120 cm de diamètre) a été remplie à une profondeur de 30 cm avec de l'eau (maintenue à 21 ° ± 1,0 ° C) qui avait été colorée en blanc par l'ajout de peinture non toxique54. Une plate-forme d'évacuation circulaire transparente (9 cm de diamètre) a été immergée au centre de l'un des quadrants de la piscine avec sa surface située à environ 1 cm sous celle de l'eau. Des repères visuels qui différaient par leur forme géométrique et leur couleur étaient répartis autour de la piscine. Des souris mâles âgées de 11 à 15 semaines et des souris femelles âgées de 11 à 16 semaines ont été initialement soumises à la tâche de plate-forme visible, dans laquelle la plate-forme était marquée d'un drapeau. Le lendemain, le drapeau a été retiré et les tâches de la plate-forme cachée ont été effectuées pendant quatre jours consécutifs. La souris a été placée au hasard dans la piscine face au mur dans chacun des quatre quadrants. Chaque tâche consistait en quatre essais par jour avec un temps limite de 60 s. Si la souris atteignait la plate-forme cible, elle était autorisée à rester sur la plate-forme pendant> 15 s. Si la souris n'a pas trouvé la plate-forme dans les 60 s, elle a été doucement guidée vers elle puis laissée là pendant > 15 s. Le 6ème jour, la plate-forme a été retirée de la piscine et un essai de sonde a été effectué pour évaluer la mémoire de l'emplacement précédent de la plate-forme. Les souris ont été autorisées à nager dans la piscine pendant 60 s, et le temps passé dans chaque quadrant a été mesuré. La locomotion de la souris a été enregistrée avec une caméra vidéo et a été analysée automatiquement avec le logiciel SMART Video Tracking (Panlab).

Chaque souris mâle à l'âge de 14 à 16 semaines ou souris femelle à l'âge de 12 à 17 semaines a été placée dans le coin d'un appareil à champ ouvert (50 par 50 par 40 cm, O'Hara & Co.), qui a été éclairé à 100 lux. La distance totale parcourue et le temps passé dans la zone centrale (25 x 25 cm) ont été enregistrés sur 10 min. La locomotion de la souris a été enregistrée avec une caméra vidéo contrôlée avec un programme sur mesure dans LabVIEW et a été analysée automatiquement avec un logiciel interne écrit en Python.

L'appareil se composait de deux bras ouverts (25 x 5 cm) et de deux bras fermés de même taille avec des parois transparentes de 15 cm de haut (O'Hara & Co.). Les bras et le carré central étaient faits de plaques de plastique blanc et étaient élevés à une hauteur de 50 cm au-dessus du sol. La probabilité que des animaux tombent de l'appareil a été minimisée par la présence de rebords en plastique de 3 mm de haut sur les bras ouverts. Des armes du même type étaient disposées de part et d'autre. Chaque souris mâle âgée de 15 à 17 semaines ou souris femelle âgée de 12 à 17 semaines a été placée dans le carré central du labyrinthe (5 par 5 cm) face à l'un des bras fermés, et son comportement a été enregistré pendant 10 min . La locomotion de la souris a été enregistrée avec une caméra vidéo contrôlée avec un programme sur mesure dans LabVIEW, et le temps passé dans les bras ouverts a été mesuré automatiquement avec un logiciel interne écrit en Python.

L'appareil consistait en une cage (21 sur 42 sur 25 cm) qui était divisée en deux sections de taille égale par une cloison avec une porte (O'Hara & Co.). Une chambre était en plastique blanc et fortement éclairée (390 lux), tandis que l'autre était noire et sombre (2 lux). Des souris mâles âgées de 14 à 17 semaines ou des souris femelles âgées de 12 à 17 semaines ont été placées du côté obscur et autorisées à se déplacer librement entre les deux chambres avec la porte ouverte pendant 10 min. La locomotion de la souris a été enregistrée avec une caméra vidéo contrôlée avec un programme sur mesure dans LabVIEW, et le temps passé dans chaque chambre a été mesuré automatiquement avec un logiciel interne écrit en Python.

Le test de toilettage a été effectué comme décrit précédemment12. Chaque souris mâle âgée de 11 à 16 semaines ou souris femelle âgée de 13 à 18 semaines a été placée individuellement dans une nouvelle cage standard. Après accoutumance pendant 10 min, l'animal a été filmé pendant une période de test de 10 min et le temps passé dans le comportement de toilettage a été déterminé.

Deux souris âgées de 15 à 17 semaines pour les mâles et de 12 à 17 semaines pour les femelles et du même génotype qui avaient été précédemment logées en groupes de génotypes mixtes (trois ou quatre animaux par cage) et dans des cages différentes ont été placées ensemble dans une boîte (50 par 50 par 40 cm, O'Hara & Co.) et laissé explorer librement pendant 10 min. Les images ont été capturées à un rythme de trois images par seconde et l'analyse a été effectuée automatiquement avec un logiciel interne écrit en Python. Le nombre total de contacts et la durée totale des contacts ont été mesurés.

L'appareil de test consistait en une boîte rectangulaire à trois chambres (O'Hara & Co.). Chaque chambre mesurait 20 sur 40 sur 30 cm et les parois de séparation étaient en plexiglas transparent, avec de petites ouvertures (6 cm) qui permettaient d'accéder à chaque chambre. Une souris non familière appariée selon le sexe (étranger 1) qui n'avait pas eu de contact préalable avec la souris sujet a été placée dans l'une des chambres latérales. L'emplacement de l'étranger 1 dans la chambre gauche ou droite a été systématiquement alterné entre les essais. La souris étrangère était enfermée dans une petite cage métallique ronde qui permettait le contact du nez entre les barreaux mais empêchait les combats. La cage mesurait 10 cm de hauteur, avec un diamètre inférieur de 10 cm et des barreaux verticaux espacés de 0,5 cm. Une cage vide identique a été placée dans l'autre chambre latérale. La souris soumise a d'abord été placée dans la chambre du milieu et a été autorisée à explorer toute la boîte de test social pendant 10 min. Le temps passé autour de chaque cage et dans chaque chambre a été mesuré à l'aide d'une caméra pour quantifier la préférence sociale pour l'étranger 1. Une deuxième souris inconnue de sexe apparié (étranger 2) a ensuite été placée dans la cage vide. La souris de test avait donc le choix entre la première souris non familière déjà étudiée (inconnue 1) et la nouvelle souris non familière (inconnue 2). Le temps passé autour de chaque cage et dans chaque chambre au cours d'une deuxième session de 10 minutes a été mesuré comme précédemment. Des souris C57BL/6J ont été utilisées comme souris étrangères, et les souris mâles et femelles utilisées dans ces tests étaient âgées respectivement de 16 à 18 semaines ou de 13 à 17 semaines. La locomotion de la souris a été enregistrée avec une caméra vidéo contrôlée avec un programme sur mesure dans LabVIEW et a été analysée automatiquement avec un logiciel interne écrit en Python.

Les données quantitatives sont présentées sous forme de moyennes ± sem ou comme indiqué, le nombre de souris soumises à chaque expérience étant également indiqué. L'analyse statistique par le test t de Student non apparié, le test t de Student apparié, l'analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) avec le test post hoc de Tukey, l'ANOVA factorielle bidirectionnelle ou l'ANOVA répétée bidirectionnelle a été réalisée avec l'utilisation du langage R . Les niveaux de signification pour les valeurs P et FDR q sont indiqués par *, **, *** et **** pour <0,05, <0,01, <0,001 et <0,0001, respectivement.

Les données sources sous-jacentes à tous les graphiques sont disponibles dans les données supplémentaires 2. Les données sont disponibles en contactant l'auteur correspondant. Les images non recadrées des immunoblots sont présentées dans la Fig. 8 supplémentaire. Les données RNA-seq et ATAC-seq ont été déposées dans l'archive de lecture de séquence DDBJ (DRA) sous les numéros d'accès DRA014131, DRA016165 et DRA016198.

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Les auteurs remercient M. Asamura, H. Kobayashi et C. Tambo pour l'assistance technique globale ; A. Toyoda (Institut national de génétique) pour l'assistance technique avec l'analyse RNA-seq et ATAC-seq ; K. Ono, T. Hamaguchi et D. Muramatsu pour l'utilisation de l'équipement pour le test du labyrinthe aquatique de Morris ; T. Miyamoto pour l'assistance générale et la discussion ; et les membres du laboratoire pour discussion. AK a été soutenu par une bourse de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS). Ce travail a été soutenu en partie par des subventions KAKENHI de JSPS et du ministère de l'Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie du Japon à MN (JP21H02847 et 16H06279 (PAGS)) et à AK (JP21K15726, JP21H05619 et 22H05493) ainsi comme par une subvention PRIME de l'Agence japonaise pour la recherche médicale et le développement (AMED) à MN (JP22gm6310008).

Département d'histologie et de biologie cellulaire, École supérieure des sciences médicales, Université de Kanazawa, Kanazawa, Ishikawa, 920-8640, Japon

Atsuki Kawamura et Masaaki Nishiyama

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AK a conçu et réalisé des expériences, analysé des données et préparé le manuscrit. MN a contribué à la supervision de l'étude et à la rédaction du manuscrit.

Correspondance à Masaaki Nishiyama.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Konstantinos Zarbalis et les autres examinateurs, anonymes, pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la gestion principale : Joao Valente. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Kawamura, A., Nishiyama, M. La suppression du gène Chd8 lié à l'autisme modifie les réponses transcriptionnelles dépendantes de l'activité dans les neurones postmitotiques de souris. Commun Biol 6, 593 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04968-y

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Reçu : 17 juin 2022

Accepté : 23 mai 2023

Publié: 02 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04968-y

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