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Aug 04, 2023

Une nouvelle nanoparticule de PLGA théranostique sensible au pH pour la thérapie par capture des neutrons du bore dans le traitement du mésothéliome

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 620 (2023) Citer cet article

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Cette étude vise à développer des nanoparticules d'acide polylactique-co-glycolique (PLGA) avec une approche innovante guidée par imagerie basée sur la Boron Neutron Capture Therapy pour le traitement du mésothéliome. Les résultats rapportés ici démontrent que les nanoparticules de PLGA incorporant des chaînes oligo-histidine et l'agent théranostique double Gd/B AT101 peuvent être exploitées avec succès pour délivrer une dose thérapeutique de bore aux cellules de mésothéliome, significativement plus élevée que dans les cellules mésothéliales saines, comme évalué par ICP- MS et IRM. La libération sélective est sensible au pH en profitant du pH légèrement acide de l'environnement extracellulaire de la tumeur et déclenchée par la protonation des groupes imidazole de l'histidine. Après irradiation avec des neutrons thermiques, la survie et la capacité clonogénique des cellules tumorales et saines ont été évaluées. Les résultats obtenus semblent très prometteurs, offrant aux patients touchés par cette maladie rare une option thérapeutique améliorée, exploitant les nanoparticules de PLGA.

Le mésothéliome malin (MM) est une tumeur agressive de mauvais pronostic dont l'incidence et la mortalité sont fonction de l'exposition passée à l'amiante, même après une période de latence de 30 à 50 ans. Le MM est reconnu comme une maladie professionnelle rare dépourvue de tout traitement efficace, et la survie médiane après le diagnostic est inférieure à 9 à 12 mois1,2. Le MM est une tumeur disséminée se propageant à l'intérieur de toute la plèvre ou du péritoine. Les radiothérapies conventionnelles ont une efficacité limitée du fait de plusieurs tissus radiosensibles, qui limitent la dose maximale délivrable aux nodules malins. De nos jours, les thérapies ciblées représentent l'un des axes majeurs de la recherche sur le cancer, et de nombreuses avancées futures dans le traitement du cancer devraient découler de cette approche. Cependant, une thérapie efficace basée sur le ciblage moléculaire contre le MM n'existe pas encore. Il reste, fondamentalement, un défi pour les cliniciens d'effectuer un diagnostic précoce du MM en raison du manque de connaissances sur les biomarqueurs précis du MM. Malgré les nombreuses études visant à trouver des biomarqueurs appropriés dans le sang et les épanchements pleuraux, ces efforts n'ont pas encore produit d'outil de diagnostic efficace3,4. Par conséquent, l'option de traitement standard reste une biopsie invasive suivie d'une chimiothérapie avec du cisplatine et du Pemetrexed, avec ou sans Bevacizumab5, avec de nombreux effets secondaires et une faible efficacité. Dans ce contexte, les nanoparticules polymères peuvent être une bonne option pour l'administration de médicaments et d'agents d'imagerie aux cellules cancéreuses du mésothéliome, améliorant l'efficacité thérapeutique et diagnostique et diminuant la toxicité hors cible6. Les nanoparticules peuvent spécifiquement libérer des médicaments sur le site de la tumeur en raison de l'effet de perméabilité et de rétention local amélioré. Parmi les différents polymères biodégradables, qui ont récemment fait l'objet d'une grande attention, les nanoparticules d'acide polylactique-co-glycolique (PLGA-NP) ont été proposées comme agents de délivrance pour le traitement du cancer7,8,9,10. Entre les systèmes d'administration de médicaments approuvés par la FDA américaine, les PLGA font partie des polymères biodégradables les plus efficaces, en raison de leurs propriétés de libération contrôlée et prolongée, de leur faible toxicité et de leur biocompatibilité avec les tissus et les cellules. Dans cet article, nous avons chargé les PLGA-NP avec un composé de diagnostic à double thérapie portant un agent de contraste d'imagerie par résonance magnétique (IRM) à base de Gd et une fraction carborane (agrégats lipophiles icosaédriques contenant des atomes de bore) utilisés pour la thérapie par capture de neutrons (NCT) . La NCT est un exemple de thérapie ciblée avec une bonne efficacité et une faible toxicité qui permet une mort cellulaire sélective des tumeurs11,12,13. Plus précisément, cette thérapie peut combiner une irradiation neutronique thermique de basse énergie avec la présence d'agents contenant du bore dans les tissus pathologiques ciblés. Les neutrons sont capturés par le 10B non radioactif, déclenchant une réaction nucléaire de décomposition libérant des particules alpha et du 7Li, causant des dommages biologiques importants dans environ 10 µm de diamètre, ce qui est inférieur au diamètre moyen d'une cellule de mammifère. Par conséquent, en administrant du bore et en produisant un rayonnement alpha de manière sélective dans les cellules malades, la NCT peut tuer les pathologiques tout en épargnant les tissus sains environnants. Ces caractéristiques font du BNCT un traitement prometteur des métastases diffuses et des tumeurs infiltrantes telles que le mésothéliome, non traitables ou résistantes aux méthodes habituellement applicables dans une masse tumorale localisée, telles que la radiothérapie conventionnelle ou la chirurgie14. Le BNCT a été appliqué aux mélanomes cutanés, aux tumeurs du cerveau, de la tête et du cou, et une grande quantité de données cliniques a été recueillie à travers les différents essais cliniques (phase I/II) menés au Japon, aux États-Unis, aux Pays-Bas, en Suède, en Finlande, en Argentine , et Taïwan15,16. Nakamura et ses collègues ont récemment développé un acide hyaluronique contenant du mercaptoundécahydro-closo-dodécaborate de sodium (BSH) spécifiquement administré au MM dans des modèles murins précliniques17. De plus, en 2006, un petit nombre de patients atteints de MM ont été traités en toute sécurité avec le BNCT au Japon, obtenant une palliation significative des symptômes18. Cependant, pour atteindre l'efficacité du BNCT, les transporteurs de bore doivent respecter différentes conditions : (i) une faible toxicité systémique ; (ii) haute sélectivité pour les cellules tumorales ; (iii) longue demi-vie au sein de la tumeur pendant toute la durée du traitement. Il a été estimé qu'environ 10 à 30 μg de B par gramme de masse tumorale sont nécessaires pour obtenir un traitement efficace, en utilisant un temps d'irradiation tolérable et une source de neutrons appropriée19. Les deux composés actuellement utilisés dans les essais cliniques sont la p-borono-l-phénylalanine (BPA) (utilisée dans les essais sur le glioblastome, le cancer de la tête et du cou et le mélanome) et le BSH (conçu pour le traitement des tumeurs cérébrales). Ces agents donnent un rapport de concentration de bore entre la tumeur et le tissu normal entre 3 et 6, permettant un traitement sûr et assez efficace. Cependant, il est largement admis dans la communauté scientifique qu'une application clinique plus large du BNCT sera possible lorsque l'adoption du ciblage des cellules tumorales sera encore améliorée19. Comme exemple d'une stratégie de ciblage réussie, les lipoprotéines de basse densité (LDL) chargées d'AT101 ont été proposées par notre groupe en tant que transporteur lipidique endogène pour l'apport spécifique de bore à différents types de tumeurs telles que le mélanome20, les métastases pulmonaires du sein21 et récemment mésothéliome22. AT101 (schéma 1) est un agent double contenant une fraction carborane fonctionnalisée avec un agent de contraste à base de Gd. Parmi les dérivés du bore, les carboranes occupent une place particulière tant pour leur forte teneur en bore (10 atomes B) que pour leur versatilité chimique couplée à une grande stabilité in vivo23,24,25,26.

Représentation schématique des nanoparticules de PLGA-His.

Dans cette étude, des nanoparticules de PLGA fonctionnalisées avec une séquence d'acides aminés unique composée de 15 résidus d'histidine (His) (CGGH15βA), à savoir PLGA-His, ont été développées pour la libération contrôlée de l'agent contenant du B à proximité du microenvironnement tumoral avec un mécanisme déclenché par le pH. En fait, le pKa de l'histidine sous sa forme oligomère est d'environ 6,827, étant ainsi inférieur à pH 7, le cycle imidazole est protoné. Cela se produit également lorsque l'oligo-His est conjugué à une chaîne polymère de PLGA formant une nanoparticule stable28. Cela a été démontré grâce à la présence d'atomes 14N d'histidine provoquant une amélioration de la relaxation quadripolaire (également appelée pic quadrupolaire, QP) à 1,39 MHz, bien détectable à l'aide d'un relaxomètre RMN à cycle de champ rapide28. L'amélioration de la relaxation dépend du pH dans la plage de 6,5 à 7,5, elle agit donc comme un rapporteur de l'intégrité des nanoparticules ou de l'échafaudage28,29. Comme il a été démontré que dans le microenvironnement du cancer, le pH est altéré et plus acide que le pH physiologique30, nous proposons ici l'utilisation de ces nanoparticules sensibles au pH contenant du B et du Gd qui interagissent sélectivement avec les membranes cellulaires pour libérer le médicament encapsulé dans la proximité des tissus tumoraux. L'utilisation de matériaux hybrides de polymères conjugués à la polyhistidine pour l'administration de doxorubicine sensible au pH est déjà rapportée dans la littérature31,32. De plus, dans cette étude, la délivrance sélective déclenchée par le pH de B et Gd contenant des NP théranostiques a été utilisée pour un traitement sélectif du mésothéliome avec BNCT. La présence de reporters IRM à base de Gd33 permet la détermination quantitative indirecte du bore sur le site cible avant et pendant l'irradiation neutronique33,34,35,36. Cette approche peut ouvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de MM, conduisant à de meilleurs résultats thérapeutiques en termes de durée de survie et de qualité de vie.

PLGA Resomer® RG 502 H, Mowiol 4–88 (poly(alcool vinylique), Mw ~ 31 000), DSPE-PEG(2000)méthoxy(1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000] et tous les autres produits chimiques et solvants ont été achetés auprès de Merk Life Science Srl (Milan, Italie).

Oligo-His-PLGA a été préparé selon la procédure rapportée précédemment28. En bref, la séquence peptidique CGGH15βA a été assemblée par synthèse automatisée de peptides en phase solide, puis conjuguée à un PLGA-PEG2-Mal, préparé en interne à partir de PLGA Resomer® RG 502 H et Maleimide-PEG2-NH2. AT101 enrichi en 10B (ligand-C-[N-(DOTAMA-C6)-carbamoylméthyl]C′-palmitamidométhyl-o-carborane enrichi en 10B) a été préparé selon la procédure rapportée précédemment37.

Les NP de PLGA ont été obtenus selon la méthode de l'émulsion h/e38. La phase organique a été préparée en dissolvant 12,5 mg de PLGA Resomer® RG 502 H, 12,5 mg d'Oligo-His-PLGA, 2,2 mg de DSPE-PEG(2000)méthoxy et 3 mg d'AT101 dissous dans 0,5 ml de 3:1 ( v/v) chloroforme-méthanol. Le PLGA-CTRL a été préparé en suivant la même procédure en dissolvant 25 mg de PLGA RG 502H, sans aucune partie du Resomer conjugué à l'oligo-histidine. La phase aqueuse consistait en 3 ml d'une solution aqueuse à 3 % (p/v) de Mowiol 4–88. La solution de PLGA organique a été mélangée avec la solution de PVA goutte à goutte et immédiatement soniquée à 4 ° C, 4 fois, pendant 1 min, à une puissance de sonication de 100 %. La phase organique a été éliminée par évaporation rotative dans un ballon rond en verre de 500 ml pendant 2 h. Après l'évaporation, le médicament non piégé a été éliminé par dialyse (seuil de poids moléculaire 14 000 Da) à 4 ° C dans 2 L de tampon isotonique NaCl / Hepes (HBS). L'excès de PVA a été éliminé en lavant la solution de NPs avec un filtre vivaspin 20 (Sartorius AG, Goettingen, Allemagne, seuil de coupure de 1 × 106 Da) et à la fin de l'étape de lavage, un volume final de 3 mL a été atteint pour toutes les suspensions de nanoparticules considérées. La quantité de Gd et de B incorporée dans les nanoparticules de PLGA a été mesurée par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS ; élément-2 ; Thermo-Finnigan, Rodano (MI), Italie) après digestion de l'échantillon effectuée avec du HNO3 concentré (70 %, 0,4 ml) par chauffage à 150 °C pendant 8′ sous système de digestion par micro-ondes (ETHOS UP Milestone, Bergame, Italie). La quantité de Gd a été contre-vérifiée par la mesure R1 par résonance magnétique nucléaire 1H à 21,5 MHz, 25 °C (Stelar Spinmaster, Mede, Italie) de la solution complexe minéralisée (dans 6 M HCl à 120 °C pendant 16 h). Le diamètre moyen hydraté et le potentiel z des nanoparticules ont été déterminés à l'aide d'un calibreur Malvern Zeta 3000HS à diffusion dynamique de la lumière (DLS). (Malvern, Royaume-Uni) Les nanoparticules ont été stockées dans l'obscurité à 4 ° C jusqu'à une analyse plus approfondie.

La stabilité des NP PLGA-CTRL et PLGA-His a été réalisée en incubant les deux NP dans 40 mL de tampon NaCl/Hepes à pH 6,0 ou 7,4 à 37 °C sous dialyse dans une membrane de 14 KDa et leurs taux de relaxation longitudinale (R1 obs ) ont été mesurés après 3, 6, 24, 48 et 72 h à 21,5 MHz et 25 °C.

Le mésothéliome murin AB22 et les lignées de cellules mésothéliales humaines saines MeT-5A ont été achetées respectivement auprès de Sigma et de l'ATCC. Les cellules AB22 ont été cultivées dans du milieu RPMI additionné de 25 mM Hepes, 10 % FBS, 1 % P/S et 2 mM de glutamine, tandis que le MeT-5A a été cultivé dans du milieu 199 additionné de 10 % FBS, 1 % P/S, 8,7 E-4 mM d'insuline bovine, 3,3E-6 mM d'EGF humain, 4E-4 mM d'hydrocortisone et d'oligoéléments B (Corning) et maintenu dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C.

5 × 105 cellules AB22 et MeT-5A ont été ensemencées dans des boîtes de Pétri de 6 cm de diamètre et maintenues jusqu'à ce que 80 % de confluence soient atteints. Par la suite, des concentrations croissantes de nanoparticules de PLGA-CTRL et de PLGA-His contenant du Gd ont été incubées pendant 24 h à 37 ° C. Après incubation, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS et décollées avec une solution de Tripsine/EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid). Ensuite, les culots cellulaires ont été remis en suspension dans 0, 2 ml de PBS, soniqués (puissance 30%, 30 s) dans de la glace et minéralisés selon la procédure rapportée précédemment. Les protéines cellulaires de chaque échantillon ont été quantifiées en utilisant le test commercial de Bradford (Biorad). Les nmoles de Gd et B internalisées par chaque échantillon cellulaire, mesurées par ICP-MS, ont été normalisées au nombre total de cellules. Le nombre de cellules a été obtenu à partir des mg de protéines cellulaires mesurés par dosage de Bradford, en utilisant la courbe d'étalonnage : [(mg protéine)/(nombre de cellules)]. A partir de cet étalonnage, 1 million d'AB22 et de MeT-5A correspondent respectivement à 0,606 et 0,435 mg de protéines. À partir des données ICP-MS, il a été possible de calculer le ppm de bore en supposant une densité d'env. 108 cellules pour cm3 dans le cas de tumeurs épithéliales (d'un diamètre allant de 15 à 20 µm)38.

Images pondérées en T1 : des capillaires en verre contenant des culots de cellules de NPs non traitées ou traitées avec des NP (0,0974 mM [Gd]) AB22 et MeT-5A ont été placés dans un fantôme d'agar et acquis par IRM à l'aide d'un spectromètre Bruker Avance Neo 300 MHz (7 T) équipé avec une sonde de microimagerie Micro 2.5 (BrukerBioSpin, Ettlingen, Allemagne). Les images T1W ont été obtenues en utilisant une séquence standard MSME (Multi-Slice Multi-Echo) avec les paramètres suivants : TR = 250 ms, TE = 3 ms, FOV = 12 × 12 mm, épaisseur de tranche = 1 mm, NEX = 6, matrice taille 128 × 128.

Des flacons T25 d'AB22 et de MeT-5A ont été traités pendant 24 h en présence de NPs PLGA-CTRL et PLGA-His (97 µM [Gd] et 970 µM [B]). Après l'incubation, les cellules ont été lavées avec du PBS et leur milieu a été renouvelé. Les flacons traités et les flacons contenant des cellules témoins non traitées ont été irradiés pendant 15' à une puissance de réacteur de 30 kW dans la colonne thermique du réacteur TRIGA Mark II de l'Université de Pavie, Italie. A la fin de l'irradiation, le milieu a été retiré, il a été remplacé par du milieu frais et les flacons ont été placés à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 pendant 24 h supplémentaires. Le lendemain, les flacons non traités et traités ont été détachés avec de la trypsine/EDTA et le test d'exclusion du bleu trypan a été effectué. La viabilité des cellules irradiées non traitées et traitées a été comparée à celle des cellules non irradiées. Le pourcentage de cellules viables de chaque condition a été calculé en fixant le nombre de cellules non traitées non irradiées à 100 % de viabilité.

Un essai clonogénique de cellules traitées et non traitées irradiées et non irradiées a été réalisé en ensemençant environ 200 cellules de chaque flacon différent dans des boîtes de culture de 6 cm de diamètre. La croissance des cellules a été suivie pendant 18 jours. Le milieu a été renouvelé après 2 à 3 jours. Après 18 jours, les cellules ont été lavées avec du PBS, fixées dans du méthanol (25 ') et colorées avec du Crystal Violet à 0, 5 % (p/v) dans de l'éthanol à 20 % (30 '). Le cristal violet a été soigneusement retiré et rincé à l'eau du robinet. Enfin, le nombre de colonies a été calculé par le logiciel ImageJ. Le % a été calculé en réglant les cellules témoins irradiées à 100 %.

La conjugaison du PLGA avec l'oligo-His (Oligo-His-PLGA) a été réalisée suivant une procédure déjà rapportée28, basée sur une réaction d'addition thiol-Michael entre PLGA-PEG2-maléimide et un oligo-His contenant une cystéine N-terminale résidu (séquence d'acides aminés : CGGHnβA, n = 15). Les PLGA-NP ont été préparés selon la méthode d'extraction par solvant en émulsion h/e38 en utilisant 100 % du PLGA disponible dans le commerce (MW = 7–17 kDa ; nommé PLGA-CTRL) ou en mélangeant 50 % de ce PLGA avec 50 % d'Oligo-His- PLGA (PLGA-His). L'agent théranostique AT101 (schéma 1) a été chargé dans les NP en l'ajoutant à la phase organique contenant des polymères PLGA. Après dialyse, la quantité d'AT101 restant encapsulée avec un très bon rendement (> 82 %), a été déterminée en mesurant à la fois B et Gd par ICP-MS. Les diamètres hydrodynamiques moyens des nanoparticules de PLGA, la relaxivité millimolaire et le potentiel de surface moyen des nanoparticules sont rapportés dans le tableau 1.

Le potentiel Z faible et légèrement négatif observé dans les deux NP est dû à l'effet de blindage des charges négatives de PLGA causées par le revêtement PVA et DSPE-PEG39,40. Pour la même raison, seule une légère augmentation du potentiel Z a été mesurée sur PLGA-His à pH < 6,5. De plus, une partie des oligo-His protonés peut rester dans le noyau des particules, réduisant ainsi leur contribution au potentiel Z mesuré (tableau 1). Les nanoparticules ont été stockées à 4°C et leur taille a été mesurée par DLS tous les 15 jours. Les résultats sont rapportés dans le tableau 2.

La relaxivité (r1p) est une expression de l'efficacité de l'agent de contraste et correspond à la contribution paramagnétique à la vitesse de relaxation longitudinale normalisée à la concentration mM de la solution de complexe Gd. PLGA-CTRL et PLGA-His montrent une valeur r1p 4 à 5 fois plus élevée (environ 18 s−1 mM−1, à 21,5 MHz et 25 °C, Tableau 1) par rapport à celles observées avec le Gd- utilisé en clinique. à base d'agents de contraste (de l'ordre de 4 à 5 mM−1 s−1)41. Ceci est une indication du long temps de culbutage rempli par les complexes AT101 lorsqu'ils sont chargés dans le NP et la sensibilité accrue réduit la limite de détection de ces sondes d'imagerie lorsqu'elles sont internalisées dans un NP. La stabilité à 37 ° C du système de délivrance a été évaluée en surveillant pendant 72 h les taux de relaxation des solutions de PLGA-NPs à pH physiologique et tumoral, dans un tampon salin (tampon Hepes-NaCl). À cette fin, des solutions contenant PLGA-CTRL et PLGA-His ont été agitées à 37 ° C, à pH 7, 4 et 6, 0, pendant 72 h sous dialyse (seuil 14 KDa). Les taux de relaxation de la solution de PLGA dans la membrane de dialyse ont été mesurés après 3, 6, 24, 48 et 72 h d'incubation. Bien que la Fig. 1 montre que les PLGA-CTRL sont essentiellement stables pendant 72 h dans ces conditions, dans le cas de PLGA-His, on a observé une augmentation de R1 (s−1) lorsqu'il est incubé à pH acide, en raison de la protonation du groupes imidazole présents dans les NP, avec une altération conséquente de sa structure physico-chimique produisant un gonflement de la NP qui facilite la perméation de l'eau. Le gonflement du NP a été confirmé en mesurant la taille du PLGA-CTRL et du PLGA-His après 24 h d'incubation à pH = 6, 0 et 37 ° C. En effet, malgré le diamètre hydrodynamique mesuré sur PLGA-CTRL resté quasiment inchangé (149,0 ± 4 nm) le diamètre mesuré de PLGA-His à pH 6,0 (160,4 ± 3,2 nm) a augmenté d'environ 12% confirmant ainsi le gonflement des nanoparticules et l'augmentation de volume. De plus, comme indiqué dans l'introduction, les chaînes oligo-histidine présentent un pic de relaxation caractéristique à 1, 38 MHz en raison de la fréquence de résonance quadripolaire nucléaire 14N des groupes imidazole présents dans la chaîne oligomérique, bien distincte des QP générés par le tissu de fond. Comme le pic de relaxation quadripolaire 14N ne peut être observé que pour les systèmes immobilisés, les changements d'intensité des QP d'imidazole peuvent agir comme un rapporteur de l'état physique de l'état solide/liquide poly-His et du gonflement lié au pH du microenvironnement. Dans la référence 28, il a été montré que la protonation du groupe imidazole de l'histidine (pKa = 6,8) augmentait le gonflement des particules et la solubilité du polymère avec une augmentation conséquente de la mobilité et une disparition progressive des QP à pH < 6,0. Malheureusement, les QP n'étaient pas détectables dans le PLGA-His utilisé dans ce travail car le complexe Gd paramagnétique chargé augmente considérablement le taux de relaxation devenant le processus de relaxation prédominant.

Taux de relaxation longitudinale (R1, s−1) de solutions HBS maintenues à 37 °C pendant 72 h maximum contenant PLGA-CTRL à pH = 7,4 (O) et pH = 6 (cercle plein) ou PLGA-His à pH = 7,4 ( carré vide) et pH = 6 (carré plein).

Afin de confirmer cette hypothèse, la concentration de Gd a été mesurée dans les solutions à l'intérieur de la membrane de dialyse (diluées 1:1 avec du tampon) après 0, 24 et 72 h d'incubation à 37 °C à pH 7,4 et 6. Les résultats rapportés dans Le tableau 3 montre que seulement à pH 6 une libération significative d'AT101 a été observée après 24 et 72 h d'incubation confirmant ainsi la stabilité réduite de la nanoparticule à ce pH.

Des études d'absorption ont été réalisées en utilisant respectivement le mésothéliome murin AB22 et, comme témoin, des lignées cellulaires de mésothélium humain sain MeT-5A. Les deux lignées cellulaires ont été incubées pendant 24 h avec des concentrations croissantes de Gd de PLGA-His et de PLGA-CTRL et après 24 h, la quantité de Gd et B internalisés a été mesurée par ICP-MS et normalisée par rapport aux protéines cellulaires totales. La figure 2 montre que l'absorption de nanoparticules par les cellules tumorales AB22 semble globalement augmentée par rapport à la lignée cellulaire mésothéliale saine MeT-5A. De plus, l'absorption des nanoparticules revêtues d'oligo-His semble être encore améliorée dans la lignée cellulaire de mésothéliome AB22 par rapport à la nanoparticule non conjuguée. En conclusion, la présence d'histidine dans PLGA-His n'affecte pas l'absorption des NP dans les cellules saines, ce qui suggère un mécanisme déclenché par le pH spécifique ne se produisant que dans les cellules malignes, ce qui rend ces NP aptes à cibler spécifiquement ce type agressif de cellules tumorales.

Étude d'absorption réalisée en incubant une concentration croissante de Gd dans PLGA-CTRL et PLGA-His sur AB22 et MeT-5A pendant 24 h à 37 ° C, 5 % de CO2.

A partir des données obtenues par analyse ICP-MS, en convertissant mg ​​de protéines en nombre de cellules (1 mg de protéine correspond respectivement à 1,7 et 6,3 millions de cellules pour AB22 et MeT-5A) et en supposant que dans le cas des tumeurs épithéliales ( avec un diamètre allant de 15 à 20 μm), une densité d'env. 108 cellules pour cm3 est un nombre raisonnable pour ces tissus tumoraux42, il a été possible de calculer le maximum de ppm de B internalisé dans les cellules, rapporté dans le tableau 4.

Par la suite, afin d'évaluer si la concentration de l'AT101 internalisé était suffisante pour générer une amélioration détectable de l'intensité du signal IRM, une image pondérée en T1 a été acquise sur des cellules AB22 et MeT-5A incubées avec PLGA-CTRL ou PLGA-His, les deux à 0,097 mM (concentration en Gd) et après lavage, centrifuger les cellules au fond de capillaires en verre. Comme nous pouvons l'observer sur la figure 3, l'absorption des nanoparticules est cohérente avec les résultats précédents, suggérant une augmentation de l'absorption du PLGA-His dans les cellules de mésothéliome par rapport aux cellules saines et également par rapport aux cellules incubées avec PLGA-CTRL.

Image IRM T1w de capillaires en verre contenant des culots cellulaires AB22 et MeT-5A incubés avec PLGA-CTRL (3 et 6), PLGA-His (2 et 5) et des cellules témoins non traitées (1 et 4).

Des cellules incubées avec des nanoparticules de PLGA encapsulant AT101 ont été irradiées avec des neutrons thermiques au réacteur nucléaire Triga Mark II de l'Université de Pavie. Pour cet ensemble d'expériences, les cellules AB22 et MeT-5A ont été pré-incubées pendant 24 h dans trois conditions différentes : (1) avec du milieu uniquement (cellules CTRL), (2) avec PLGA-CTRL et (3) avec PLGA-His . Les PLGA-NPs ont été incubés à une concentration correspondant à une concentration de Gd de 0,097 mM dans le milieu cellulaire. Les cellules ont été irradiées à la colonne thermique pendant 15' avec une puissance de réacteur de 30 kW. Comme le montre la figure 4A, un fort effet cytotoxique du BNCT est clairement détecté sur les cellules AB22, avec une diminution significative du nombre de cellules 24 h après l'irradiation. En effet, après irradiation, par rapport au groupe témoin irradié, 30% des cellules AB22 traitées avec PLGA-CTRL sont mortes, et concernant PLGA-His, le pourcentage passe à 60%. Au contraire, les cellules MeT-5A n'ont montré aucune diminution significative 24 h après l'irradiation, ce qui correspond à la faible absorption de NP de ce type de cellule (comme le montrent la figure 2 et le tableau 2). Cette observation est étayée par les résultats obtenus avec le dosage clonogénique réalisé au jour 18 après irradiation. En fait, la figure 4B montre que AB22 après irradiation, en particulier s'il est traité avec PLGA-His, cesse de former des colonies. Ces résultats suggèrent une diminution significative de la capacité des cellules de mésothéliome à se recoller et lorsqu'elles sont traitées avec des PLGA NPs, particulièrement efficace dans le cas de l'administration de PLGA-His. Au contraire, les cellules saines MeT-5A ne montrent qu'une formation de colonies légèrement réduite par rapport aux cellules témoins non traitées irradiées.

(A) Comptage cellulaire normalisé 24 h après irradiation neutronique, effectué sur AB22 et MeT-5A préalablement traités avec PLGA-CTRL ou PLGA-His et comparés à des cellules non traitées. La signification statistique a été déterminée par le test T de Student (***P < 0,01) ; (B) dosage clonogénique réalisé 18 jours après irradiation neutronique. Le nombre de colonies a été calculé par le logiciel ImageJ. Le % a été calculé en réglant les cellules témoins irradiées à 100 %.

Le mésothéliome est un cancer agressif associé à l'exposition à l'amiante. Bien que l'amiante soit interdit dans plusieurs pays, une épidémie de mésothéliome devrait toucher les pays à revenu intermédiaire au cours de ce siècle en raison de leur forte consommation d'amiante. Les patients touchés par cette maladie présentent souvent un mauvais pronostic en raison du manque de thérapies significatives et efficaces puisque la chimiothérapie conventionnelle ne parvient pas à affecter et à éradiquer efficacement ce sous-type de cancer43. Bien que des travaux récents aient trouvé d'importantes possibilités de traitement, identifiant des vulnérabilités génétiques et physiopathologiques, le mésothéliome reste l'un des cancers avec le taux de survie le plus faible. Par conséquent, dans cet article, nous devons démontrer la possibilité d'une approche innovante, basée sur la Boron Neutron Capture Therapy, avec un composé théranostique délivré par des nanoparticules de PLGA. Nous avons développé et caractérisé des nanoparticules de PLGA contenant des chaînes poly-histidine, capables de retenir efficacement le composé théranostique AT101 et de le délivrer spécifiquement aux cellules tumorales, profitant ainsi pleinement de cette radiothérapie pré-ciblée. Il a été démontré dans cet article comment ces nanoparticules sont préférentiellement captées par le mésothéliome que par les cellules mésothéliales saines, suggérant la possibilité d'une approche thérapeutique ciblée dans la guérison de cette terrible maladie. Par conséquent, les cellules de mésothéliome AB22 ont été fortement affectées par l'irradiation neutronique provoquant leurs dommages irréversibles, alors qu'un pourcentage élevé de cellules saines a été épargné par le même traitement, comme l'a également démontré le test clonogénique. Par conséquent, nous proposons le BNCT comme une stratégie thérapeutique alternative possible pour traiter le mésothéliome.

Les ensembles de données utilisés et analysés au cours de l'étude en cours seront partagés sur demande. Les demandes doivent être adressées à l'auteur correspondant.

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La recherche menant à ces résultats a reçu un financement de l'AIRC dans le cadre de l'IG 2019—ID. 23267 (PI Geninatti Crich Simonetta) et du projet de l'Institut national italien de physique nucléaire : Enter_BNCT et le ministère italien de l'Université et de la Recherche (MUR) pour le financement annuel FOE du nœud italien d'imagerie moléculaire multimodale Euro-BioImaging (MMMI).

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Conceptualisation : SGC, AD, JS ; méthodologie : SGC, AD, JS, DA, SA ; enquête : JS, DA, AL, PR, SP, RS, NP, BV ; analyse : JS, DA, VB, AL rédaction—ébauche originale : SGC, JS, DA ; rédaction—révision et édition : AD, PR, AL, SP, SGC, SA, NP ; financement acquisition : SGC, AD, SA, NP

Correspondance à Annamaria Deagostino ou Simonetta Geninatti Crich.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Sforzi, J., Lanfranco, A., Stefania, R. et al. Une nouvelle nanoparticule de PLGA théranostique sensible au pH pour la thérapie de capture des neutrons du bore dans le traitement du mésothéliome. Sci Rep 13, 620 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-27625-0

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Reçu : 13 novembre 2022

Accepté : 04 janvier 2023

Publié: 12 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-27625-0

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