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May 07, 2023

Structure et mécanisme de l'alcane

Volume Communication Nature

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 2180 (2023) Citer cet article

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Les alcanes sont la forme de carbone la plus riche en énergie et sont largement dispersés dans l'environnement. Leur transformation par les microbes représente une étape clé du cycle global du carbone. L'alcane monooxygénase (AlkB), une métalloenzyme qui traverse la membrane, convertit les alcanes à chaîne droite en alcools dans la première étape de la dégradation microbienne des alcanes, jouant ainsi un rôle essentiel dans le cycle global du carbone et la bioremédiation du pétrole. La biodiversité d'AlkB est attribuée à sa capacité à oxyder des alcanes de différentes longueurs de chaîne, tandis que les AlkB individuels ciblent une gamme relativement étroite. Les mécanismes de la sélectivité du substrat et de l'activité catalytique restent insaisissables. Nous rapportons ici la structure cryo-EM d'AlkB, qui fournit une architecture distincte pour les enzymes membranaires. Nos études structurelles et fonctionnelles révèlent une configuration inattendue du centre de diiron et identifient les déterminants moléculaires de la sélectivité du substrat. Ces découvertes donnent un aperçu du mécanisme catalytique d'AlkB et éclairent sa fonction dans les micro-organismes dégradant les alcanes.

Les hydrocarbures sont omniprésents. Jusqu'à 800 millions de tonnes sont rejetées chaque année par une combinaison de suintements naturels, de rejets accidentels de l'industrie pétrolière et de l'activité biologique des cyanobactéries1,2,3. Ces molécules sont une riche source de nourriture pour les bactéries métabolisant les hydrocarbures et ont des impacts majeurs sur les écosystèmes4,5. Ainsi, une étape indispensable du cycle du carbone est la transformation enzymatique des alcanes liquides pour les rendre biologiquement utiles.

Les bactéries qui peuvent métaboliser les alcanes liquides se trouvent dans le monde entier, de la région équatoriale6,7 aux golfes touchés par le pétrole8 aux sols vierges riches en hydrocarbures de l'Arctique et de l'Antarctique7,9,10,11,12,13,14,15,16, 17,18,19,20,21,22. Dans ces environnements, la principale enzyme qui catalyse l'oxydation des alcanes liquides est l'alcane monooxygénase (AlkB). AlkB oxyde une gamme d'alcanes à chaîne droite et est répandu dans diverses bactéries qui utilisent les alcanes comme seule source de carbone et d'énergie10,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35,36,37. En effet, il s'agissait du gène le plus différentielment exprimé dans la communauté microbienne qui s'est développée rapidement après la marée noire de Deepwater Horizon38.

AlkB appartient à la superfamille des désaturases d'acides gras membranaires (FADS), qui représente un groupe de monooxygénases non hémiques de difer qui désaturent ou hydroxylent les chaînes aliphatiques d'acyle gras39. Reflétant la plasticité catalytique de la superfamille membranaire de type FADS, AlkB hydroxyle sélectivement le groupe méthyle terminal des alcanes à chaîne droite; d'autres membres de la famille introduisent respectivement des doubles liaisons ou des groupes hydroxyle dans des substrats à base de lipides. Le premier aperçu de la structure de ces biocatalyseurs uniques a été fourni par les structures de la stéaroyl-CoA désaturase SCD1 de mammifère et de la sphingolipide α-hydroxylase de levure Scs7p40,41,42,43. À l'exception des motifs riches en histidine de signature, AlkB ne partage pas de similitudes de séquence significatives ou de partenaires de transfert d'électrons avec ces deux familles d'enzymes d'acides gras. La configuration exacte du centre diiron d'AlkB reste incertaine. Des AlkB fonctionnels ont également été identifiés dans des genres pathogènes, tels que Mycobacterium tuberculosis H37RV, Legionella pneumophilia souche Philadelphie et Pseudomonas aeruginosa PAO131,36,44, ce qui suggère qu'AlkB peut alimenter la croissance d'agents pathogènes36. Plus de 20 000 séquences de protéines AlkB ont été identifiées, reflétant sa large distribution dans les micro-organismes.

Malgré son importance fondamentale pour le cycle mondial du carbone et pour la santé humaine, le mécanisme catalytique d'AlkB reste mystérieux et la structure de l'enzyme n'a pas encore été déterminée expérimentalement. Des questions mécanistes centrales restent sans réponse : quelles caractéristiques différencient AlkB des enzymes d'acides gras et lui permettent d'hydroxyler sélectivement le groupe méthyle terminal des alcanes linéaires ; quelles caractéristiques différencient un AlkB d'un autre, ce qui, à son tour, dote toute la famille d'une gamme de substrats remarquablement large qui en fait une pierre angulaire du cycle mondial du carbone. Le manque d'informations a laissé un vide substantiel dans notre compréhension de la façon dont la structure d'AlkB facilite son fonctionnement et a considérablement entravé son application à la biotechnologie.

AlkB fait partie d'un nombre relativement restreint d'enzymes dont la fonction établie est de transformer les alcanes en alcools dans des conditions ambiantes (Fig. 1a). Il s'agit d'une réaction chimiquement difficile en raison de la nature non polaire de la liaison CH et de sa grande énergie de dissociation, ainsi que des défis associés à l'activation sélective de l'O2. D'autres enzymes oxydant les alcanes comprennent les méthane monooxygénases contenant du cuivre (pMMO), les enzymes cytochrome P450 contenant de l'hème, deux enzymes dépendantes de la flavine LadA et AlmA45 et une autre enzyme difer non hémique, la méthane monooxygénase soluble (sMMO). AlkB est unique parmi les enzymes oxydant les alcanes car il présente un environnement de ligand riche en azote entourant le centre métallique; les autres enzymes difer non hémiques ont des centres de fer riches en carboxylates. Cela suggère qu'AlkB a un mécanisme catalytique distinct. Depuis des décennies d'études fonctionnelles n'ont pas réussi à définir ce mécanisme, nous avons cherché à obtenir des informations structurelles sur son site actif.

a Étapes clés de la dégradation biologique des alcanes. Les AlkB initient le métabolisme des alcanes en transformant les alcanes en alcools. b Activité d'hydroxylation d'alcane de FtAlkB sur l'octane. Un profil GC-MS représentatif du pic d'octanol de FtAlkB (noir) et contrôle négatif sans FtAlkB (rouge). Les expériences ont été répétées trois fois indépendamment et des résultats similaires ont été observés. L'activité de la protéine purifiée correspond à 225 chiffres de rotation soit 5 µmoles de produit par mg de protéine. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. c Occupation en fer de FtAlkB déterminée par ICP-MS (NC, contrôle négatif ; moyenne ± SEM ; n = 3 expériences indépendantes). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. d Carte de densité Cryo-EM du complexe FtAlkB-nanocorps. e Structure globale de FtAlkB, vue parallèle à la membrane. Deux atomes de fer sont représentés par des sphères d'olive.

Nous rapportons ici une structure cryo-EM d'AlkB et des caractérisations concomitantes de ses activités catalytiques. Notre étude révèle l'architecture de cette famille d'enzymes, les principales caractéristiques du centre du diiron et les déterminants moléculaires de la sélectivité des sous-états, qui aident à concilier plus de 50 ans de données sur ce moteur important mais insaisissable du cycle mondial du carbone.

Pour faciliter les études structurales sur AlkB, nous avons systématiquement caractérisé les comportements biochimiques d'un large panel d'homologues d'AlkB. Fontimonas thermophila AlkB (FtAlkB), qui partage 62% d'identité de séquence avec le prototype Pseudomonas oleovorans AlkB (GPo1AlkB, Fig. 1 supplémentaire), s'est avéré prometteur en termes de rendement et de stabilité des protéines (Fig. 2a supplémentaire). FtAlkB a affiché des activités alcane hydroxylase robustes sur un alcane octane modèle (5 μmoles de produit / mg de protéine), qui se compare favorablement à l'AlkB le plus actif que nous ayons précédemment caractérisé (4, 5 μmoles de produit / mg de protéine pour Alcanivorax borkumensis AlkB46) (Fig. 1b). Ces attributs ont fait de FtAlkB un excellent candidat pour les études structurales et mécanistes.

Étant donné que l'activité catalytique d'AlkB dépend du fer, nous avons mesuré la teneur en fer de FtAlkB à l'aide de la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS). Nos résultats ont montré que le FtAlkB purifié est chargé en fer, alors que nous n'avons pas détecté de fer au-dessus du bruit de fond dans une protéine témoin. De plus, nous n'avons pas détecté de zinc au-dessus du niveau de fond (Fig. 1c). Ces résultats montrent que FtAlkB lie spécifiquement le fer. La teneur en fer spécifique est d'environ deux ions de fer par molécule de protéine, conformément aux observations structurelles que nous présentons ci-dessous.

Pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la réaction catalysée par AlkB, nous avons effectué des études cryo-EM à une seule particule sur FtAlkB purifié dans le détergent n-dodécyl-β-d-maltopyranoside (DDM, Fig. 3 supplémentaire et tableau supplémentaire 1 ). Pour surmonter la taille relativement petite de la protéine (45 kD) et faciliter l'alignement des particules, nous avons développé un nanocorps qui se lie spécifiquement à FtAlkB et forme un complexe stable (Fig. 2b supplémentaire). A l'aide d'un nanocorps comme marqueur fiducial, nous avons obtenu des reconstructions 3D de FtAlkB à une résolution de 3,45 Å (avec un masque sur FtAlkB uniquement ; 3,59 Å avec un masque sur FtAlkB-nanocorps), et la résolution locale de FtAlkB atteint 2,8 Å à 3,2 Å. La carte de haute qualité de FtAlkB nous a permis de tracer sans ambiguïté la protéine et de construire un modèle (Fig. 1d, e et Fig. 4a supplémentaire).

La structure FtAlkB est constituée d'un domaine transmembranaire (TMD) et d'un domaine catalytique. La règle « positive-inside »47 prédit que les extrémités N et C de FtAlkB doivent résider du côté intracellulaire de la membrane, plaçant le domaine catalytique de manière intracellulaire. Ceci est cohérent avec la localisation intracellulaire des partenaires redox qui interagissent vraisemblablement près du domaine catalytique. Dans le TMD, six MT sont disposées en forme de tente avec leurs extrémités cytosoliques séparées les unes des autres, créant une grande interface pour accueillir le domaine catalytique (Fig. 1e). De plus, les hélices H2 et H3 forment une boucle de rentrée insérée à mi-chemin dans la membrane. À l'interface membrane-cytosol, trois hélices parallèles à la surface de la membrane aident à ancrer le domaine cytosolique sur la membrane et à positionner les éléments structuraux pour soutenir la formation du site actif. Les extrémités cytoplasmiques de TM4 et TM6 dépassent de la membrane et fournissent deux motifs riches en histidine qui coordonnent les deux ions de fer. Le site diiron est en outre entouré de deux segments cytoplasmiques où résident les deux autres motifs riches en histidine: une hélice-tour-hélice entre TM4 et TM5 et une longue extrémité C-terminale avec de courtes hélices α (Fig. 4g supplémentaire).

Sur la base d'une recherche dans la banque de données sur les protéines à l'aide du serveur Dali48, FtAlkB ne partage pas de similitude structurelle significative avec d'autres protéines ayant des structures expérimentales. AlkB représente un pli qui diffère considérablement des autres familles de protéines connues, y compris celles de la superfamille de type FADS, telles que la désaturase d'acide gras SCD1 et la sphingolipide α-hydroxylase Scs7p (Fig. 4e – g supplémentaire).

Dans FtAlkB, deux ions de fer sont coordonnés par neuf résidus d'histidine provenant de quatre motifs riches en histidine conservés (Fig. 2a et Fig. 1 supplémentaire). Un fer est coordonné par cinq anneaux imidazole tandis que l'autre est lié par quatre (Fig. 4b supplémentaire). Ces résidus d'histidine sont invariants d'une espèce à l'autre et se sont avérés indispensables pour les fonctions enzymatiques de GPo1AlkB39,49. La géométrie de coordination des deux fers présente certaines caractéristiques d'un arrangement octaédrique, l'autre fer apparaissant le long de l'axe où un ligand manque; cela laisse les deux ions de fer séparés d'environ 5,4 Å. Notre structure représente directement un environnement riche en azote du centre du diiron dans AlkB. Cela corrobore l'identité des ligands métalliques supposée à partir d'études spectroscopiques antérieures d'AlkB50, et cela contraste fortement avec la coordination riche en oxygène trouvée dans d'autres monooxygénases connues d'alcane difer non hémiques. Nous avons également observé des différences fondamentales dans la configuration des centres diiron entre AlkB et d'autres diiron alcanes monooxygénases, telles que sMMO. Premièrement, la distance entre les deux ions dans FtAlkB est plus longue à ~ 5,4 Å par rapport à la distance fer-fer de 3 Å dans sMMO. Deuxièmement, aucun ligand de pontage n'est observé pour FtAlkB, alors que sMMO a des groupes carboxylate et hydroxyde pontant deux ions de fer. Ces différences clés indiquent qu'AlkB peut utiliser un mécanisme non signalé auparavant pour l'oxygénation des alcanes.

une structure de FtAlkB avec une vue rapprochée de la coordination diiron. Les résidus d'histidine de coordination et un glutamate environnant sont représentés en bâtonnets. b Alignements de motifs histidine conservés. c Superposition de centres de diiron dans les membres de la superfamille de type FADS.

Cette configuration di-métallique d'AlkB est étayée par des observations dans d'autres protéines métabolisant les lipides de la superfamille de type FADS, notamment les désaturases d'acides gras et les α-hydroxylases sphingolipidiques. Bien qu'AlkB partage une séquence globale limitée et une similitude structurelle avec eux, les motifs riches en histidine signature d'AlkB sont organisés de manière similaire dans l'espace, et les résidus d'histidine coordonnant le fer forment un site de liaison au diiron qui ressemble à ceux des désaturases d'acides gras et des sphingolipides α-hydroxylases (Fig. 2b, c). L'espacement variable entre les résidus d'histidine est compensé par des conformations hélicoïdales distinctes. Ces observations suggèrent un certain degré de mécanisme catalytique partagé entre ces centres de difer riches en azote.

Néanmoins, il existe des différences importantes : il existe un groupe carboxyle d'un résidu de glutamate conservé, E281, dans AlkB qui est proche de Fe1 (le fer coordonné par quatre résidus d'histidine) qui pourrait potentiellement interagir avec ce fer et les résidus d'histidine à proximité, bien que le côté chaîne de E281 n'est pas suffisamment résolue dans la carte cryo-EM. En revanche, une molécule d'eau occupe une position similaire dans SCD1 tandis que Scs7p possède une histidine supplémentaire formant cinq coordinations d'histidine pour les deux fers (Fig. 2c). Ces différences dans le milieu environnant des fers peuvent affecter la réactivité des fers et la stabilité des intermédiaires de réaction, qui peuvent jouer un rôle dans les réactions distinctes catalysées par ces enzymes.

Comprendre comment les substrats hydrophobes inertes atteignent le site actif d'AlkB est essentiel pour élucider sa capacité de traitement des hydrocarbures. TM2, TM4 et TM6 forment un vestibule allongé qui s'étend du domaine TM au domaine catalytique et atteint juste au-dessus du site actif. Le vestibule est tapissé principalement de résidus hydrophobes et le diamètre du vestibule est compatible avec la liaison des alcanes (Fig. 3a). Fait intéressant, nous avons trouvé une densité non protéique tubulaire allongée occupant le vestibule (Fig. 3b et Fig. 4c supplémentaire). Une extrémité de la densité tubulaire est proche du site actif et l'extrémité distale est proche de W62. La forme de la densité est compatible avec une chaîne acyle, et les résidus hydrophobes environnants pourraient aider à loger un alcane. Nous avons provisoirement placé le dodécane dans la densité en fonction de la correspondance de longueur, bien que l'identité moléculaire de la densité ne puisse pas être résolue sans ambiguïté à cette résolution. L'extrémité de l'alcane est positionnée à une distance similaire aux deux fers (~ 5, 1 Å et ~ 5, 7 Å, respectivement; Fig. 4d supplémentaire).

a Une vue en coupe du canal de substrat de FtAlkB. Deux atomes de fer sont représentés par des sphères d'olive. b Une vue rapprochée de la densité de ligands équipés de dodécane. Les résidus de cavité clés sont représentés en bâtonnets. c Activités d'hydroxylation des alcanes des mutants FtAlkB sur l'octane, normalisées au type sauvage (moyenne ± SEM ; n = 3 expériences indépendantes). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Parmi les résidus de revêtement vestibule, trois résidus de leucine, L274, L315 et L318, sont hautement conservés (Fig. 1 supplémentaire). L274 et L318 interagissent avec l'alcane près de son extrémité (le site d'oxydation) du côté opposé. Ces deux résidus permettent ainsi de bien positionner l'alcane pour la réaction catalytique. L315, situé à la partie distale de la cavité hydrophobe, entre également en contact avec l'alcane (Fig. 3b). De plus, le motif conservé L315X2L318 relie une hélice hydrophobe (H4) au dernier motif riche en histidine (H321X2HH325). Dans nos études fonctionnelles, le remplacement du tryptophane par L274 ou L318 a supprimé l'activité catalytique de FtAlkB (Fig. 3c). En revanche, la substitution L315W a eu peu d'effet sur l'activité. Ces résultats mettent en évidence l'importance de la taille de la chaîne latérale pour L274 et L318, conformément à leur rôle proposé dans le positionnement du substrat pour le site actif. La région distale du canal de substrat, où se trouve L315, peut s'adapter à une plus grande variabilité pendant la catalyse.

Dans le vestibule du substrat, W62 occupe une position stratégique, se tassant contre le dernier segment de l'alcane. W62 et L141 (qui interagissent avec l'extrémité de l'alcane de l'autre côté) définissent une partie étroite du vestibule. Cette région étroite peut présenter un obstacle pour accueillir les alcanes avec plus de 12 carbones. Notamment, des études antérieures ont montré que la position équivalente de W62 dans GPo1AlkB (W55) est corrélée à la capacité différentielle des bactéries à se développer sur des alcanes : GPo1AlkB et ses proches homologues avec le tryptophane dans cette position peuvent se développer sur des alcanes de 5 à 12 carbones, avec la longueur optimale de la chaîne alcane étant proche de 8. En revanche, les AlkB qui possèdent un petit résidu hydrophobe (A, V, L ou I) à la même position peuvent métaboliser des alcanes plus longs, en particulier ceux avec au moins 12 carbones44,49,51 . Ces observations sont cohérentes avec un rôle important pour W62.

Pour tester davantage l'hypothèse selon laquelle les résidus qui restreignent le canal du substrat dictent la sélectivité du substrat, nous avons évalué l'activité de FtAlkB et de sa variante W62V sur des alcanes allant de 5 à 14 carbones (Fig. 4a, b et Supplémentaire Fig. 5a). FtAlkB est actif sur les alcanes de 6 à 12 carbones, avec une activité optimale sur l'heptane et l'octane. Pour les alcanes avec > 12 carbones, nous n'avons observé aucune activité détectable. La variante W62V a clairement modifié la sélectivité du substrat : elle a montré des activités relatives significativement accrues pour les alcanes à chaîne plus longue tels que le décane, l'undécane et le dodécane. Le mutant W62V peut également oxyder le tridécane et le tétradécane. Nos expériences utilisant GPo1AlkB ont montré une tendance similaire (Fig. 5b supplémentaire). Fait intéressant, une récente étude de mutagenèse sur D. cinnamea AlkB a montré que le changement d'un acide aminé moins volumineux à la position équivalente à W62 de FtAlkB en un acide plus volumineux (V91W) diminuait les activités sur des alcanes plus longs52. Ces résultats soulignent le rôle important que joue la taille de la chaîne latérale de cette position dans la détermination de la longueur des substrats optimaux.

a, b Activités d'hydroxylation d'alcanes de WT (a) et W62V (b) sur des alcanes linéaires allant de 5 à 14 carbones (moyenne ± SEM ; n = 4 expériences indépendantes pour WT, n = 3 expériences indépendantes pour W62V). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. c Voies latérales potentielles pour l'entrée du substrat ou la libération du produit. Le dodécane est représenté en orange. Les résidus clés sont représentés par des bâtons cyan et les courtes hélices sélectionnées sont représentées en rouge.

Tous ces résultats ensemble sont cohérents avec un modèle dans lequel chaque AlkB a développé un canal de substrat qui correspond étroitement à la taille de ses alcanes cibles, un peu comme un long gant de soirée s'adapte étroitement à la main et au bras qui y glisse.

Notre structure de FtAlkB révèle l'architecture de cette famille d'enzymes importantes. AlkB adopte un pli protéique non observé expérimentalement auparavant, tout en partageant une géométrie de coordination di-métal globalement conservée avec les désaturases d'acides gras membranaires et les α-hydroxylases sphingolipidiques. Le modèle AlphaFold53 (AF-A0A1I2KHB9-F1) s'aligne bien avec notre structure FtAlkB (écart quadratique moyen (rmsd) = 1,163 Å, Fig. 4e supplémentaire), démontrant sa capacité à prédire un pli structurel inconnu. D'autre part, le manque d'ions métalliques dans la structure prédite AlphaFold limite ses connaissances catalytiques.

Nos études structurelles et fonctionnelles fournissent des informations importantes sur la manière dont AlkB atteint la sélectivité du substrat. Le groupe méthyle terminal du substrat est positionné près du site actif du diiron. Un acide aminé volumineux ~13 Å du site actif différencie les AlkB qui oxydent préférentiellement les alcanes d'environ huit carbones de ceux qui oxydent efficacement les alcanes plus longs (et oxydent simultanément moins efficacement les alcanes plus courts54), qui ont un résidu moins volumineux dans cette position. Il est concevable que l'acide aminé volumineux puisse servir de barrière aux alcanes plus longs tout en aidant à maintenir en place les alcanes non polaires de taille optimale54. Potentiellement, d'autres caractéristiques structurelles dans le canal de substrat pourraient fournir une discrimination supplémentaire. Notre structure fournit ainsi une base pour les efforts futurs visant à concevoir AlkB pour des applications biotechnologiques.

Dans notre structure AlkB, TM2, qui ancre l'extrémité distale du substrat, n'interagit pas avec les TM adjacents du côté cytosolique, laissant des ouvertures latérales à la bicouche lipidique. Chaque ouverture est gardée par une hélice hydrophobe parallèle à la membrane, suggérant une porte possible qui permet l'entrée du substrat ou la libération du produit (Fig. 4c). Cela suggère que TM2 pourrait contrôler une voie latérale qui permet aux substrats d'entrer dans le canal et aux produits d'en sortir. Une telle porte latérale permettrait aux alcanes qui se répartissent dans la membrane d'atteindre le site actif via les canaux de substrat de forme adaptée d'AlkB. De même, après la réaction, les produits alcooliques seraient libérés par la même voie afin qu'ils puissent être davantage oxydés via le système d'oxydation des acides gras pour fournir de l'énergie et une source de carbone à la bactérie.

L'activation sélective de la liaison CH est un Saint Graal de la chimie55. Ainsi, la façon dont les membres de la superfamille de type FADS effectuent la chimie d'activation du CH suscite depuis longtemps un vif intérêt. Notre structure fournit des informations précieuses sur ce processus. Dans notre structure, AlkB positionne le groupe méthyle terminal près du site actif du diiron. Pour les désaturases d'acides gras, les liaisons CC internes sont positionnées pour être désaturées. Ces observations suggèrent ensemble que les membres de la superfamille de type FADS positionnent des substrats à longue chaîne alkyle dans un canal de substrat de telle manière que les liaisons à rompre soient adjacentes au site actif. On pense que la catalyse crée un intermédiaire commun à haute valence qui peut bifurquer pour désaturer ou hydroxyler.

Nous et d'autres avions émis l'hypothèse que la superfamille de type FADS génère un intermédiaire catalytiquement compétent qui est similaire au composé Q de l'autre enzyme d'activation diiron CH bien caractérisée, sMMO54,56,57,58,59. On pensait que deux ions fer d'AlkB seraient connectés électroniquement pour fournir un avantage énergétique dans le partage des intermédiaires déficients en électrons qui sont nécessaires pour extraire un atome d'hydrogène d'une liaison CH forte. De manière inattendue, notre structure montre que le site actif riche en azote d'AlkB a une longue distance entre les deux ions de fer et manque de ligand de pontage. Cette configuration est fondamentalement différente du centre diiron non hémique riche en oxygène du sMMO. Au lieu de cela, le site actif d'AlkB ressemble à celui des désaturases d'acides gras membranaires et des α-hydroxylases sphingolipidiques (indépendamment du fer lié ou de l'ion zinc incorporé accidentellement dans ces deux enzymes). Ces configurations de sites actifs comparables observées à partir de plusieurs enzymes distinctes dans différentes conditions suggèrent fortement que le centre diiron formé par les résidus d'histidine dans la superfamille de type FADS diffère suffisamment de celui de sMMO pour nécessiter un intermédiaire catalytique distinct.

La structure présentée ici, combinée aux travaux mécanistes antérieurs de notre groupe, nous permet de spéculer sur le mécanisme d'AlkB46, 54, 58, 59, 60, 61 (Fig. 6 supplémentaire). La longue distance observée entre les deux ions de fer suggère un mécanisme dans lequel les deux fers jouent des rôles différents, l'un servant de relais d'électrons et de site de liaison à l'eau, tandis que l'autre ion de fer sert de site de catalyse. Le transfert d'électrons couplés aux protons (PCET) d'une espèce Fe(II)-OH2 sur le fer un au deuxième ion fer où O2 est lié, formerait une espèce peroxo ferrique et une espèce hydroxyde ferrique, qui seraient facilement protonées. Le clivage hétérolytique de la liaison OO formerait une espèce hydroxo ferrique sur un fer, de l'eau et l'oxo Fe (V) catalytiquement compétent sur l'autre fer. Cette hypothèse est soutenue par le fait que la seule autre métalloenzyme avec une durée de vie radicale du substrat comparable à AlkB est la naphtalène dioxygénase (NDO), où une espèce oxo formellement Fe (V) est postulée comme étant l'espèce active62. Comme on l'a vu avec les espèces oxo Mn(V), la structure électronique de l'espèce rebondissante (dans le cas d'AlkB, Fe(IV)-OH) impacte la durée de vie du radical63. Il reste également possible qu'il y ait un réarrangement substantiel du site actif au cours de la réaction, non observé dans notre structure, ce qui pourrait conduire à un mécanisme de réaction de type sMMO64. La caractérisation spectroscopique détaillée des intermédiaires de réaction fera l'objet de travaux futurs.

L'ADN codant pour FtAlkB (acides aminés 4 à 399) a été optimisé en codons et cloné dans le vecteur pRSF (Novagen). La protéine était surexprimée dans E. coli BL21 (DE3). Les cellules ont été cultivées à 37 ° C et induites par IPTG 0, 2 mM en présence de 10 mg / L de Fe3 + à 30 ° C pendant 5 h. Les cellules culottées ont été remises en suspension dans un tampon de lyse (HEPES 20 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, imidazole 20 mM) et rompues par sonication. FtAlkB a été solubilisé par 1% de DDM (Anatrace) à 4 ° C pendant 1 h, puis isolé du surnageant clarifié par une résine de cobalt. Après une nuit de digestion avec la protéase 3C, l'éluant FtAlkB a été incubé avec le nanocorps AP32 à un rapport molaire de 1:2. Le complexe a été purifié par chromatographie d'exclusion de taille (SEC) sur une colonne d'augmentation Superdex 200 (GE Healthcare) dans un tampon contenant 20 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl et 0,02% DDM et soumis à une analyse cryo-EM.

Les cellules exprimant AlkB ont été centrifugées et remises en suspension dans un tampon de lyse et ouvertes par un seul passage à haute pression dans la presse française, puis centrifugées à 7000 × g pendant 20 min. A 0,5 mL de surnageant cellulaire, on a ajouté 0,5 mL de surnageant cellulaire provenant de cellules exprimant AlkG et AlkT et 2 μL de substrat purifié. La réaction a été initiée en ajoutant suffisamment de NADH pour atteindre une concentration de travail de 12,3 mM. Les tests ont été incubés sous agitation à 37°C pendant 30 min. A la fin de la période d'incubation, la réaction a été désactivée avec 100 μL de CHCl3. Le mélange a été vortexé pendant 1 min, puis centrifugé à 16 200 × g pendant 5 min. La couche organique a été transférée et injectée dans une chromatographie en phase gazeuse Agilent 7820 A avec un détecteur sélectif de masse (MSD) Agilent 5977E. 1 μL d'échantillon a été injecté dans une colonne Agilent HP-5 avec une température d'injecteur de 275 °C et un rapport de division de 25:1. La température initiale du four était de 45 °C, avec un temps de maintien de 2,25 min. La température du four a ensuite été augmentée à raison de 10 °C par minute jusqu'à une température finale de 225 °C. L'identité de chaque composé a été déterminée en comparant manuellement le schéma de fragmentation de chaque pic à celui d'un étalon authentique, injecté dans des conditions identiques et élué en même temps. Les intensités maximales ont été déterminées par intégration manuelle du courant ionique total (TIC) à l'aide de la MSD ChemStation F.01.03.2357. Tous les tests d'activité comprenaient un contrôle avec substrat + tampon et un contrôle avec AlkG, AlkT, NADH et substrat. Les protéines purifiées ont été dosées de manière similaire, sauf que l'AlkG purifié, la ferrédoxine réductase de maïs et le NADPH ont été utilisés46,65.

Les protéines purifiées ont été digérées pendant une nuit dans du HNO3 à 50 % puis bouillies pendant 30 min. Les échantillons ont été dilués avec de l'eau milli-Q à 5 % de HNO3 et soumis à un spectromètre ICP-MS (Thermo Scientific XSERIES 2). Les protéines AlkB et le témoin négatif, transporteur semiSWEET ne contenant pas de fer, ont été préparés en parallèle. Des étalons de fer ont été utilisés pour l'étalonnage.

Un nanocorps spécifique à FtAlkB a été généré à partir d'une bibliothèque de nanocorps synthétiques selon des protocoles publiés66,67. Après trois cycles de sélection, le candidat nanocorps individuel a été séquencé et exprimé dans E. coli BL21 (DE3). Les nanocorps purifiés ont été validés par leur capacité de liaison à FtAlkB par un test pull-down et une SEC analytique. Nanobody AP32 a été identifié pour former un complexe stable avec FtAlkB. Le complexe a été soumis à des études cryo-EM.

Pour la préparation des échantillons, 3 μL de FtAlkB concentré (19 mg/ml) ont été incubés sur des grilles de carbone perforées fraîchement déchargées (Quantifoil Au R1.2/1.3 300 mesh) pendant 5 s, buvardées (temps 3, force 3) puis cryorefroidi dans de l'éthane liquide sur un Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) à 4 ° C sous 100% d'humidité. Les grilles ont été criblées sur un Titan Krios de 300 kV avec détecteur Falcon 4 et filtre d'énergie Selectris (largeur de fente 10 eV). Pendant un temps d'exposition de 8,14 s, 50 images de film ont été collectées par le logiciel EPU (Thermo Fisher Scientific) à une taille de pixel physique de 0,95 Å avec une défocalisation de 1,6 μm à 2,2 μm et une dose d'exposition aux électrons de 50 électrons par Å2.

Un total de 5072 films a été corrigé en mouvement par MotionCorr268, produisant des images pondérées en fonction de la dose et des images additionnées. Les images pondérées en fonction de la dose ont été importées et traitées dans cryoSPARC v3.369. La fonction de transfert de contraste (CTF) des images a été estimée par estimation Patch CTF. Des images avec une résolution CTF meilleure que 8 Å ont été sélectionnées, donnant 4 965 images. Un demi-ensemble de données a été utilisé pour la sélection automatique par des modèles générés à partir du sélecteur Blob. Après classification 2D, 51 617 particules avec différentes vues ont été utilisées pour la formation dans Topaz v0.2.470. Par la suite, 1 739 854 particules au total ont été extraites avec une taille de boîte de 160 pixels et un regroupement 2 × 2 et soumises à une classification 2D, un raffinement hétérogène et une reconstruction Ab-Initio. Le sous-ensemble bien défini de 242 089 particules a été réextrait avec une taille de boîte de 224 pixels et affiné pour produire une carte de 4,47 Å dans un raffinement non uniforme avec les paramètres de résolution passe-bas initiale de 12 Å, la minimisation sur l'échelle par particule activée et cinq passes finales supplémentaires. Pour améliorer encore la densité, une classification 3D multi-références guidée facilitée par les semences a été réalisée71. Les multi-références incluent des références précises et biaisées générées par la reconstruction Ab-Initio, des cartes de gradient de résolution (carte de 4,47 Å et deux autres cartes avec une résolution filtrée passe-bas de 10 Å et 20 Å) et des cartes repondérées par le bruit (4,47 Å map et deux autres cartes que la micelle a été réduite d'un facteur de 0,3 et 0,7). Après reconstruction Ab-Initio et élimination des particules dupliquées, 253 772 particules ont été réextraites et soumises à un raffinement hétérogène avec uniquement des cartes repondérées par le bruit, ce qui a donné 3,84 Å. Les 145 869 particules résultantes et les 242 089 particules du traitement initial ont été combinées. Les doublons ont été supprimés après un cycle de raffinement hétérogène. Après deux autres cycles de raffinement hétérogène, un total de 107 776 particules a donné une carte à 3,72 Å. La carte finale a été reconstruite (FSC = 0,143) à 3,59 Å pour FtAlkB-nanobody ou 3,45 Å pour FtAlkB via un raffinement local et un raffinement CTF local. Cette carte a été affinée respectivement par DeepEMhancer72 pour une meilleure densité de nanocorps et cryoSPARC pour une meilleure densité de ligand. La résolution locale a été calculée par BlocRes dans cryoSRARC.

Le modèle AlphaFold253 FtAlkB a été intégré à la densité dans Chimera et reconstruit manuellement dans Coot73. Un modèle de nanocorps de PDB 7SL8 a été intégré à la carte cryo-EM et les régions déterminant la complémentarité (CDR) ont été reconstruites manuellement à l'aide de la prédiction AlphaFold2. Le modèle FtAlkB-nanobody a été affiné dans Phenix74 et a été évalué par MolProbity. Les statistiques de raffinement rapportées dans le tableau supplémentaire 1 sont basées sur la carte de précision DeepEMhancer. Les figures ont été préparées à l'aide de PyMOL (Schrödinger, LLC)75, UCSF Chimera76 ou ChimeraX77.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données à l'appui de cette étude sont disponibles sur demande auprès des auteurs correspondants. La carte FtAlkB-nanobody a été déposée dans la banque de données de microscopie électronique (EMDB) sous le code d'accession EMD-40303 (FtAlkB-nanobody). Le modèle FtAlkB-nanobody se trouve dans la Protein Data Bank (PDB) sous 8SBB. Les modèles de structure précédemment publiés ont été téléchargés à partir de PDB en utilisant les codes d'accession 6WF2, 4ZR1, 7SL8 Les données sources liées aux Figs. 1b, c, 3c, 4a, b et la Fig. 5b supplémentaire sont fournies avec cet article. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Télécharger les références

Merci à Jacob Austin qui a aidé à développer le test d'activité. Merci à de nombreux étudiants du groupe d'Austin pour les discussions fructueuses sur la structure et la fonction d'AlkB au cours des 20 dernières années. Merci à Jamie Ross pour son aide dans la collecte de données ICP-MS. SW et JL ont reçu des bourses Beckman. Une reconnaissance spéciale au professeur Jay T. Groves, dont les travaux de laboratoire sur AlkB ont commencé dans le cadre d'un centre financé par la NSF pour la chimie bioinorganique environnementale (CEBIC NSF9810248) et dont l'engagement intellectuel dans ce travail a été inestimable. Ce travail a été rendu possible grâce au soutien du NIH R01 GM130989 (RNA & LF). Les fonds pour l'achat de l'ADN initial utilisé dans le criblage à grande échelle d'AlkB provenaient d'un prix de recherche présidentiel à l'ARN du Barnard College. Une partie de ce travail a été réalisée au Stanford-SLAC Cryo-EM Center (S2C2) soutenu par le programme NIH Common Fund Transformative High-Resolution Cryo-Electron Microscopy (U24 GM129541). Le soutien au travail dans le laboratoire d'Austin provient également d'un généreux don de Roy et Diana Vagelos, que nous remercions également avec gratitude.

Juliette Lee

Adresse actuelle : Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, California Institute of Technology, Pasadena, CA, 91125, États-Unis

Shoshana C.Williams

Adresse actuelle : Department of Chemistry, Stanford University, Stanford, CA, 94305, États-Unis

Allison Forsberg

Adresse actuelle : Department of Chemistry, University of Southern California, Los Angeles, CA, 90007, États-Unis

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Xue Guo, Jianxiu Zhang, Lei Han.

Département de physiologie moléculaire et cellulaire, École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, CA, 94305, États-Unis

Xue Guo, Jianxiu Zhang, Lei Han, Yan Xu et Liang Feng

Département de chimie, Barnard College, 3009 Broadway, New York, NY, 10027, États-Unis

Juliet Lee, Shoshana C. Williams, Allison Forsberg et Rachel Narehood Austin

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XG et JL ont effectué la sélection initiale et la vérification des candidats. XG, LH et JZ ont effectué des études cryo-EM. XG, LH et YX ont effectué une ICP-MS. JL, SW, AF et RNA ont effectué des études fonctionnelles. RNA et LF ont dirigé le projet. XG, RNA et LF ont rédigé le manuscrit.

Correspondance avec Rachel Narehood Austin ou Liang Feng.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Rhys Grinter et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Guo, X., Zhang, J., Han, L. et al. Structure et mécanisme de l'enzyme AlkB oxydant les alcanes. Nat Commun 14, 2180 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37869-z

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Reçu : 23 mars 2023

Accepté : 03 avril 2023

Publié: 17 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-37869-z

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