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Aug 06, 2023

PEG2000

Rapports scientifiques volume 12,

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 10564 (2022) Citer cet article

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Compte tenu de notre intérêt pour l'utilité des liposomes pour l'imagerie moléculaire et le théranostic, nous avons étudié comment le revêtement de la couche externe du liposome affecte l'internalisation par les lignées cellulaires du cancer du sein in vitro et dans les tissus tumoraux du sein in vivo. En effet, nous avons découvert qu'une absorption liposomale remarquablement élevée peut être obtenue par un revêtement souple de DBCO (dibenzocyclooctyne). Nos données démontrent que la décoration du lipide terminal avec un fragment DBCO à une densité spécifique induit une absorption tumorale accrue in vivo (absorption tumorale ~ 50 %) par rapport au liposome non décoré conventionnel (absorption tumorale ~ 20 %). Dans cette étude, nous rapportons une meilleure visualisation des cellules cancéreuses du sein in vivo à l'aide d'un modèle de cancer du sein orthotopique 4T1 et de modèles de xénogreffe de tumeur mammaire primaire MDA-MB-231 et MDA-MB-436. Les liposomes revêtus de L-PEG2000-DBCO démontrent une accumulation accrue dans les cellules cancéreuses du sein indépendamment de la taille de la tumeur, du type, de la position, de l'expression du récepteur, ainsi que de l'état des souris hôtes. Nous nous attendons à ce que ces découvertes aient un impact positif majeur sur l'utilité pratique des liposomes dans les applications guidées par l'image et le théranostic de la médecine de précision.

Les liposomes sont des vésicules lipidiques constituées d'une bicouche lipidique encapsulant un noyau aqueux et sont considérés parmi les véhicules de délivrance de médicaments les plus prometteurs et les plus efficaces1,2. Les liposomes ont été largement étudiés au cours des trois dernières décennies pour optimiser leur potentiel clinique. Parmi les applications les plus réussies des liposomes dans l'administration de médicaments figurent les deux formulations de doxorubicine liposomale (Doxil, Myocet) approuvées pour une utilisation clinique dans le cancer de l'ovaire et le myélome multiple, entre autres maladies3,4,5. Cependant, malgré ces succès thérapeutiques, le développement clinique des liposomes en imagerie moléculaire et en théranostic guidé par l'image est nettement plus en retard. Jusqu'à présent, la principale limitation à surmonter est l'absorption liposomale relativement faible par les tissus tumoraux. Il existe un besoin non satisfait de nouvelles formulations liposomales capables de faciliter une forte absorption tumorale afin de faciliter la traduction clinique de ces incroyables nanoporteurs.

Les modifications de surface permettent la conception personnalisée de liposomes pour des applications diagnostiques, thérapeutiques et guidées par l'image6,7,8,9,10,11. Les avantages uniques des liposomes comprennent une réactivité immunitaire minimale, une dégradation protéolytique réduite, des temps de circulation accrus et un assemblage reproductible de manière rentable. En conséquence, les liposomes sont des outils nanoporteurs presque magiques pour le diagnostic, la surveillance et la gestion des maladies humaines12,13.

Compte tenu de notre intérêt pour le développement clinique des liposomes pour l'imagerie moléculaire théranostique, nous avons étudié comment le revêtement de la couche externe du liposome à une densité de surface spécifique affecte l'internalisation cellulaire in vitro et in vivo. En effet, nous avons découvert qu'une absorption liposomale remarquablement élevée par les tissus tumoraux peut être obtenue in vitro et in vivo par un revêtement souple de DBCO (dibenzocyclooctyne). Nos données montrent que la décoration du lipide terminal avec un fragment DBCO à densité spécifique produit une absorption tumorale profonde in vivo (~ 50 %) par rapport au liposome traditionnel non décoré (absorption tumorale ~ 20 %). Dans un modèle animal, nous avons pu visualiser une absorption accrue par les cellules orthotopiques du cancer du sein 4T1 et les xénogreffes des lignées cellulaires primaires du cancer du sein MDA-MB-231 et MDA-MB-436. Nos résultats sont cohérents avec les découvertes récentes selon lesquelles les interactions entre la surface liposomale et la membrane cellulaire influencent de manière significative l'absorption cellulaire. Une meilleure compréhension de la façon dont la surface liposomale régule les voies d'internalisation des cellules présente une opportunité pour améliorer l'administration intracellulaire de médicaments14.

Nos découvertes ouvriront la voie au développement de la prochaine génération de liposomes avec des propriétés de surface modifiées qui facilitent l'absorption efficace des tumeurs et, à leur tour, démontrent un immense potentiel d'utilisation clinique en médecine de précision théranostique. Nous prévoyons d'exploiter les avantages de ces liposomes améliorés pour la chirurgie guidée par l'image de précision, la détection précise de la tumeur avec des radiotraceurs de tomographie par émission de positrons (TEP) et le traitement de la tumeur via une administration précise de la charge utile radiothérapeutique à la tumeur primaire et à ses métastases distantes. Ces études ambitieuses sont en cours dans notre laboratoire et seront publiées en temps voulu.

Les liposomes ont été assemblés comme illustré à la Fig. 1a en suivant ces étapes : les lipides du squelette (DOPC), les lipides fonctionnels (DSPE-PEG2000-DBCO ou DSPE-PEG2000) et les matériaux d'imagerie (DiI ou DiR) ont été dissous dans du chloroforme et ont formé le film mince suivi d'une réhydratation, d'une extrusion et d'une dialyse. La taille et le potentiel zêta étaient respectivement d'environ 95 nm et - 4,8 mV (tableau S1). La morphologie de surface de L-PEG2000-DBCO a été imagée à l'aide de la microscopie électronique à balayage (MEB), comme illustré à la Fig. 1b. Le diamètre de L-PEG2000-DBCO (L-DBCO) était d'environ 96 nm avec une distance de 25 Å entre les bornes DBCO adjacentes (Fig. 1b et Tableau S1).

Assemblage L-PEG2000-DBCO avec une densité DBCO souhaitable : (a) schéma de la procédure d'assemblage liposomal et (b) la morphologie de surface L-PEG2000-DBCO a été imagée à l'aide de la microscopie électronique à balayage (SEM) et le réseau de revêtement DBCO est représenté par un schéma de carton pour montrer la structure potentielle de la morphologie de surface L-PEG2000-DBCO.

Nous avons utilisé la cytométrie en flux et la microscopie confocale in vitro pour démontrer que le L-PEG2000-DBCO est supérieur au L-PEG2000 conventionnel. Comme prévu, aucune différence significative dans l'absorption cellulaire n'a été observée par cytométrie en flux entre L-PEG2000 (marqué avec DiI) et L-PEG2000-DBCO (marqué avec DiI) dans une lignée cellulaire non néoplasique (Vero), comme le montre la Fig. 2a. En revanche, L-PEG2000-DBCO a présenté une absorption cellulaire plus élevée dans les cellules cancéreuses du sein : MCF-7, MDA-MB-231 et MDA-MB-436, comme le montre la Fig. 2b – d. La valeur moyenne des pics DiI, L-PEG2000 et L-PEG2000-DBCO pour différentes cellules a été répertoriée dans le tableau S1 (matériel supplémentaire). L'intensité du signal de la coloration L-PEG2000-DBCO a augmenté de 258 %, 303 %, 255 % dans MCF-7, MDA-MB-231 et MDA-MB-436 respectivement par rapport à L-PEG2000. Prises ensemble, ces données démontrent que les deux formulations liposomales (marquées avec DiI) distinguent les cellules normales des cellules cancéreuses du sein et que le L-PEG2000-DBCO est supérieur à l'accumulation dans les cellules cancéreuses du sein par rapport au L-PEG2000. De plus, nous avons utilisé la microscopie confocale pour confirmer davantage nos résultats. L'intensité de coloration du L-PEG2000-DBCO a augmenté de 244 % dans les cellules MDA-MB-231 par rapport au L-PEG2000, comme le montre la figure 2e.

Études de cytométrie en flux et de microscopie confocale utilisant des formulations liposomales marquées avec DiI (sauf que le faux représente le milieu de culture) : (a) lignée cellulaire non néoplasique (Vero), (b) lignée cellulaire tumorale primaire Her2/neu+ (MCF-7), ( c) Lignée cellulaire de cancer du sein triple négatif (TNBC) (MDA-MB-231), (d) Lignée cellulaire de cancer du sein triple négatif (TNBC) à potentiel métastatique élevé (MDA-MB-436) et (e) Microscopie confocale de liposomes formulations dans les lignées cellulaires MDA-MB-231.

Nous avons utilisé l'imagerie optique in vivo pour confirmer davantage et nous appuyer sur les données in vitro ci-dessus. Nous avons testé les performances de L-PEG2000-DBCO et L-PEG2000 dans une petite tumeur orthotopique (15 ~ 25 mm3) pour imiter les foyers métastatiques ou les foyers de rechute après résection chirurgicale16,17. Il a été rapporté que la croissance tumorale et la propagation métastatique des cellules 4T1 chez les souris BALB/c imitaient le cancer du sein humain de stade IV18. En effet, les données présentées sur les figures 3a à c démontrent une absorption tumorale supérieure du L-PEG2000-DBCO par rapport au liposome L-PEG2000. Le L-PEG2000-DBCO présente une absorption remarquablement élevée dans les foyers tumoraux, atteignant 54 %, tandis que l'absorption hépatique était limitée à 16 %. En revanche, le L-PEG2000 n'a pas réussi à détecter cette petite tumeur avec 77% de liposome piégé par le foie et le système ER (Fig. 3c, d). Le taux d'accumulation des deux formulations liposomales dans les tissus tumoraux est illustré sur les figures 3c, d. Dans l'ensemble, le L-PEG2000-DBCO a affiché une augmentation de 700 % de l'accumulation de tumeurs par rapport au L-PEG2000.

Détection de petits foyers de cancer du sein allogénique (4T1 avec une taille de tumeur de 15 ~ 25 mm3) avec L-PEG2000-DBCO. (a,b) comparaison côte à côte de l'absorption tumorale obtenue par (a) L-PEG2000 et (b) L-PEG2000-DBCO ; (c) évolution temporelle de la biodistribution de L-PEG2000 et L-PEG2000-DBCO dans la tumeur sur 120 h et (d) évolution temporelle de la biodistribution de L-PEG2000 et L-PEG2000-DBCO dans le foie sur 120 h.

De plus, une deuxième administration liposomale après 96 h n'a pas entraîné d'accélération de la clairance sanguine. Il a été rapporté que l'administration répétée de substances conjuguées au PEG, y compris les liposomes PEGylés, peut provoquer une réponse immunogène entraînant une clairance accrue et une efficacité réduite des substances conjuguées au PEG/des nanoporteurs PEGylés19,20,21.

Nous avons ensuite étendu nos études à d'autres xénogreffes de cancer du sein et confirmé la capacité de L-PEG2000-DBCO à détecter les xénogreffes de tumeurs breact. Comme le montre la figure 4, le L-PEG2000-DBCO s'est accumulé avec une concentration élevée dans les xénogreffes tumorales MCF-7 (211 mm3), MDA-MB-231 (507 mm3) et MDA-MB-436 (232 mm3).

Imagerie optique de xénogreffes de cancer du sein avec L-PEG2000-DBCO : MCF-7 (211 mm3), MDA-MB-231 (507 mm3) et MDA-MB-436 (232 mm3).

Nous avons ensuite excisé les tissus hépatiques et tumoraux des souris avec une xénogreffe tumorale MDA-MB-231 et effectué une imagerie optique ex vivo et une microscopie confocale. Les résultats étaient également cohérents avec les données ci-dessus confirmant la supériorité du L-PEG2000-DBCO sur le L-PEG2000. Comme le montre la Fig. 5, le L-PEG2000-DBCO a surpassé le L-PEG2000 de plus de trois fois dans la tumeur et s'est accumulé 40% de moins dans le foie (Fig. 5b, c). De plus, la microscopie confocale a également démontré une absorption tumorale plus élevée et une absorption moindre du L-PEG2000-DBCO par rapport au L-PEG2000 (Fig. 5d). Dans l'ensemble, les résultats in vivo et ex vivo soutiennent fortement la haute performance du L-PEG2000-DBCO à s'accumuler avec une concentration élevée dans les tissus tumoraux, ce qui souligne l'immense potentiel d'utilité du L-PEG2000-DBCO en tant que puissant nanoporteur de diverses molécules. applications d'imagerie et guidées par l'image.

Imagerie optique ex vivo et microscopie confocale avec L-PEG2000-DBCO et L-PEG2000 dans les tissus tumoraux et le foie de la xénogreffe tumorale MDA-MB-231 : (a) expérience de contrôle démontrant une intensité de fluorescence égale de L-PEG2000 et L-PEG2000- DBCO, (b) imagerie optique ex vivo avec L-PEG2000-DBCO et L-PEG2000 dans les tissus tumoraux et le foie, (c) absorption quantitative basée sur l'intensité du signal fluorescent de L-PEG2000-DBCO et L-PEG2000 dans les tissus tumoraux et le foie 24 h après l'administration des liposomes et (d) imagerie par microscopie confocale de L-PEG2000-DBCO et L-PEG2000 dans des coupes de tissu tumoral et de foie.

Pour finaliser et renforcer nos découvertes, nous avons examiné l'utilité de L-PEG2000-DBCO in vivo pour démontrer la capacité remarquable de L-PEG2000-DBCO à visualiser de petites tumeurs. En effet, L-PEG2000-DBCO a pu détecter une petite tumeur mammaire sous-cutanée (MDA-MB-231, taille 10 ~ 20 mm3) qui était invisible à l'œil nu et en champ clair, comme indiqué par les flèches sur les Fig. 6a,b . Il est important de noter que la petite tumeur est implantée dans le coussinet adipeux et qu'il était donc difficile de l'isoler du tissu para-cancéreux. En conséquence, la taille de la tumeur sur la figure 6b semble être plus grande que la taille précise de la tumeur solide telle qu'elle a été mesurée par le pied à coulisse (la photo est montrée sur la figure S4). De plus, la figure 6b indique que notre L-PEG2000-DBCO a une super capacité de ciblage sur les tissus cancéreux et para-cancéreux, car le signal du tissu para-cancéreux est illustré sur la figure 6b. De plus, le L-PEG2000-DBCO était supérieur au L-PEG2000 dans les xénogreffes tumorales de plus grande taille, comme le montre la figure 6b. L'imagerie optique ex vivo a également confirmé les données in vivo, comme le montre la figure 6c.

(a) L'imagerie optique avec L-PEG2000-DBCO a permis la détection du stade précoce de la tumeur mammaire sous-cutanée (MDA-MB-231 avec une taille de tumeur de 10 ~ 20 mm3, 3 jours après l'implantation, invisible à l'œil nu et en champ clair comme indiqué par flèches); (b) imagerie optique ex vivo de la tumeur et des principaux organes avec L-PEG2000-DBCO et (c) imagerie optique de la xénogreffe tumorale MDA-MB-231 avec L-PEG2000 par rapport à L-PEG2000-DBCO.

Malgré des travaux importants sur la technologie des liposomes au cours des dernières décennies, les approches pour optimiser la formulation de surface des liposomes sont restées largement inexplorées. Nos résultats démontrent un rôle clé pour les fractions fonctionnelles de surface dans l'internalisation cellulaire et l'absorption tumorale. Les surfaces liposomales ont été largement utilisées pour conjuguer des médicaments (le soi-disant liposome ciblé) pour diverses applications thérapeutiques, certaines utilisant le fragment DBCO comme site de conjugaison de médicaments par le biais d'une "chimie du clic" sans cuivre22,23,24. Cependant, la conjugaison de surface peut réduire l'efficacité de l'internalisation cellulaire liposomale et de l'absorption tumorale, réduisant ainsi l'efficacité de l'administration du médicament. Dans cette étude, nous avons découvert que le revêtement de la surface liposomale avec le fragment DBCO (L-PEG2000-DBCO) peut conduire à une absorption tumorale remarquablement élevée. Nous avons effectué une série d'expériences in vitro, in vivo et ex vivo pour démontrer que le L-PEG2000-DBCO est supérieur au L-PEG2000 conventionnel. Nous avons initialement étudié l'absorption liposomale dans des cellules cancéreuses normales et mammaires in vitro par cytométrie en flux et microscopie confocale. La cytométrie en flux a indiqué une absorption plus élevée de L-PEG2000-DBCO par rapport au L-PEG2000, une découverte qui a été confirmée par la microscopie confocale (Fig. 2). Étant donné que l'imagerie optique peut être utilisée efficacement pour surveiller le trafic liposomal in vitro et in vivo via le colorant fluorescent encapsulé dans la bicouche lipidique liposomale, nous avons utilisé l'imagerie optique pour suivre la biodistribution de L-PEG2000-DBCO in vivo dans divers modèles de cancer du sein. Dans une expérience de contrôle, des solutions de liposomes avec des volumes égaux de L-PEG2000 et L-PEG2000-DBCO présentaient une intensité de fluorescence similaire (Fig. 5a et Figure S2), justifiant l'utilisation de l'intensité de fluorescence comme mesure pour quantifier la biodistribution liposomale in vitro et in vivo et ex vivo. L'examen des tumeurs du sein (Figs. 3, 4, 5, 6) a démontré que le L-PEG2000-DBCO était préférentiellement absorbé in vivo par les tissus tumoraux et une absorption réduite dans le foie et la rate par rapport au L-PEG2000. Par exemple, les données in vivo obtenues avec la xénogreffe tumorale MDA-MB-231 ont montré que l'intensité du signal tumoral du L-PEG2000-DBCO et du L-PEG2000 était de 12,2 × 1010 et 3,9 × 1010 p/sec/sr/mW (Fig. 5c), respectivement, correspondant à une augmentation de 213 % de l'accumulation tumorale de L-PEG2000-DBCO par rapport au L-PEG2000. En revanche, l'intensité du signal hépatique du L-PEG2000 et du L-PEG2000-DBCO était de 11,2 × 1010 et 6,3 × 1010 p/sec/sr/mW, correspondant respectivement à une réduction de 46 % de l'absorption hépatique du L-PEG2000-DBCO par rapport à L-PEG2000. De plus, des coupes de tissus tumoraux et hépatiques imagées par microscopie confocale ont confirmé l'imagerie optique in vivo et ex vivo (Fig. 5d).

Nous nous attendons à ce que nos découvertes trouvent une application dans la livraison efficace de composés d'imagerie moléculaire, de sondes guidées par l'image et de thérapies contre le cancer. L'un des avantages est la capacité du L-PEG2000-DBCO à visualiser de petites tumeurs telles qu'un petit implant orthotopique 4T1 (Fig. 2). L-PEG2000-DBCO a pu détecter une petite tumeur mammaire sous-cutanée (MDA-MB-231, taille 10 ~ 20 mm3) qui était invisible à l'œil nu et en champ clair, comme indiqué par les flèches sur la Fig. 6. Pris ensemble , les données des Fig. 3 et 6 démontrent que L-PEG2000-DBCO a montré la capacité de visualiser la petite tumeur dans les modèles de transplantation allogénique (4T1) et xénogénique (MDA-MB-231). De plus, L-PEG2000-DBCO a été capable de détecter, de visualiser et de faire la distinction entre une petite tumeur (10 ~ 15 mm3) et la tumeur principale adjacente MDA-MB-231 (196 ~ 255 mm3) et de s'accumuler dans la petite tumeur avec le même densité de signal de celle de la grosse tumeur (Figure S3). Par conséquent, nous poursuivons actuellement l'utilité de L-PEG2000-DBCO pour l'imagerie moléculaire et la chirurgie guidée par l'image.

Le mécanisme qui entraîne l'absorption tumorale élevée de L-PEG2000-DBCO et comment cela est facilité par le fragment DBCO n'est pas entièrement compris. Par exemple, la conjugaison de L-PEG2000-DBCO avec les peptides DV1-N3 entraîne une diminution de l'absorption tumorale, similaire à L-PEG2000, soulignant le rôle clé du fragment DBCO dans la conduite d'une absorption tumorale élevée12. Il est probable que l'effet d'amélioration de la perméabilité et de la rétention (EPR) contribue à l'augmentation de l'absorption tumorale. De longs temps de circulation permettent au liposome de pénétrer préférentiellement dans le tissu tumoral à travers un système vasculaire tumoral perméable et de rester dans le lit tumoral grâce à un drainage lymphatique altéré25. Cependant, il a été rapporté que l'effet EPR à lui seul offrait moins du double de l'administration de nano-médicaments25,26. D'autres études sur les liposomes marqués au DBCO seront nécessaires pour aider à démêler le mécanisme de la forte accumulation de L-PEG2000-DBCO dans les tissus tumoraux et de la faible accumulation dans les tissus non cibles qui entraînent habituellement la toxicité thérapeutique. Des modifications chimiques améliorées des liposomes marqués au DBCO peuvent conduire à des formulations améliorées avec une spécificité tumorale améliorée. Ces études sont en cours dans notre laboratoire et feront l'objet de publications futures.

En résumé, la surface du liposome peut influencer de manière significative l'absorption cellulaire in vitro et la pénétration in vivo dans les tissus tumoraux tout en minimisant la pénétration dans les tissus hors cible. Nous sommes optimistes que nos découvertes ouvriront la voie à la conception de liposomes de nouvelle génération pour une livraison efficace de l'imagerie moléculaire et des sondes guidées par l'image ainsi que des thérapies anticancéreuses.

Nous avons effectué une série d'expériences in vitro et in vivo pour démontrer que la modification de la surface liposomale peut jouer un rôle clé dans l'induction d'une internalisation cellulaire élevée in vitro et d'une accumulation liposomale élevée dans les tissus cancéreux in vivo. Plus précisément, nous avons découvert qu'une couche molle de DBCO induit une augmentation remarquable de l'absorption tumorale du L-PEG2000-DBCO par rapport au L-PEG2000 malgré le fait que les deux formulations liposomales partagent un squelette identique. Nous avons démontré la capacité accrue de L-PEG2000-DBCO à s'accumuler dans les foyers de cancer du sein indépendamment de la taille, du type, de la position, de l'expression du récepteur de la tumeur, ainsi que de l'état des souris hôtes. Remarquablement, une réduction significative de l'absorption de L-PEG2000-DBCO dans le foie et les tissus hors cible a également été observée par rapport au L-PEG2000. Au total, nos découvertes ouvriront la voie au développement de nouvelles formulations liposomales avec une meilleure internalisation par les tissus tumoraux. Nous explorons actuellement l'utilité de L-PEG2000-DBCO en tant que support efficace d'imagerie moléculaire et de sondes guidées par l'image.

1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[dibenzocyclooctyl(polyéthylène glycol)-2000] (sel d'ammonium) (DSPE-PEG2000-DBCO), 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine -N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000] (sel d'ammonium) (DSPE-PEG2000) et 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC) ont été achetés chez Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Le perchlorate de 1,1′-dioctadécyl-3,3,3′,3′-tétraméthylindocarbocyanine (DiI) a été acheté chez Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). L'amine Cy5 (non sulfonée) a été achetée auprès d'APExBIO Technology LLC (Houston, Texas). L'iodure de (1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindotricarbocyanine) (DiR) a été acheté chez Biotium™ (Fremont, CA). Le sérum de veau fœtal certifié (FBS) a été obtenu auprès de Gibco® par Life Technologies Corporation (Grand Island, NY). La membrane gravée sur piste Nuclepore (taille des pores : 100 nm, 200 nm) a été obtenue auprès de Whatman (Florham Park, NJ).

Un liposome modifié avec du PEG2000-DBCO (L-PEG2000-DBCO) et un liposome recouvert de PEG2000 (L-PEG) ont été préparés par la méthode d'extrusion15. En bref, un mélange de DOPC : DSPE-PEG2000-DBCO : colorant DiR (97 :2 :1, mol :mol :mol) ou DOPC : DSPE-PEG2000 : colorant DiR (97 :2 :1, mol :mol :mol) ont été solubilisés dans du chloroforme et séchés à l'évaporateur rotatif sous pression réduite. Notamment, le colorant DiR peut être remplacé par DiI et Cy5-amine selon la conception expérimentale souhaitable. Le film lipidique a été hydraté dans 5 mL d'eau DI (pH 7,0) sous agitation douce pour donner une solution lipidique 2,6 mM. La solution lipidique a subi 10 cycles de congélation-décongélation pour former des liposomes multilamellaires. Les liposomes ont été extrudés via une extrudeuse Northern Lipids avec des membranes nanoporeuses en polycarbonate de 200 nm et 100 nm de manière séquentielle. Après extrusion, la solution de liposomes a été dialysée dans un tampon Tris – HCl (pH 7, 4) à l'aide d'une cassette de dialyse Slide-A-Lyzer (MWCO 100 kDa) pendant une nuit à température ambiante (TA).

La diffusion dynamique de la lumière (DLS) a été utilisée pour surveiller l'intégrité, la taille et le potentiel zêta des vésicules pendant et après la réaction de couplage.

Les liposomes (1 ml, 2, 6 μM de lipides) ont été colorés avec 1% d'OsO4 dans du PBS 0, 1 M dans un bain de glace pendant 1 min. La solution a été filtrée à travers une membrane de 100 nm à nuclépore gravée. Le film a été déshydraté dans une série graduée d'éthanol (50%-75%-100%-100%) pendant 15 min à chaque étape. Le film a été séché par Critical Point Drying selon les instructions du fabricant. Le film a été collé au sommet du disque en acier avec du ruban conducteur, pulvérisé avec de l'or et utilisé pour la détection SEM.

Toutes les lignées cellulaires ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). La cellule épithéliale rénale non néoplasique de Cercopithecus aethiops - lignée cellulaire normale du rein (Vero), lignée cellulaire humaine de cancer du sein primaire Her2 / neu + (MCF-7), lignées cellulaires humaines de cancer du sein triple négatif (MDA-MB-NT17631 et MDA- MB-436) et la lignée cellulaire de cancer épithélial mammaire de souris (4T1) ont été utilisées dans nos études actuelles. Toutes les lignées cellulaires cancéreuses ont été cultivées dans du DMEM avec 10 % de FBS et 100 unités de pénicilline-streptomycine. Toutes les cellules ont été maintenues à 37°C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2.

Pour la liaison des liposomes analysée par cytométrie en flux, Vero, MCF-7, MDA-MB-231 et MDA-MB-436 (2 × 106) ont été ensemencés dans un flacon de 75 cm2 pendant 2 à 5 jours. Après avoir atteint 50 % de confluence, les cellules ont été détachées par 0,25 % de trypsine/0,1 % d'EDTA, puis lavées deux fois avec du PBS. Après blocage avec BSA (1%) pendant 30 min, les échantillons ont été colorés avec des liposomes avec du colorant DiI pendant 2 h à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 (0, 15 mM de lipides pour 106 cellules). Après deux lavages avec du PBS, les échantillons ont été remis en suspension dans 500 μL de PBS et évalués par cytométrie en flux à l'aide d'un analyseur BD LSR II (B&D Bioscience, CA).

L'absorption liposomale dans les cellules a été analysée par microscopie confocale. Les cellules MDA-MB-231 (2 × 105) ont été ensemencées séparément dans un système de lame de chambre Lab-Tek II avec 2 ml de milieu pendant une nuit à 37 ° C. Les échantillons ont été colorés avec des liposomes avec du colorant DiI pendant 2 h à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 (0, 15 mM de lipides pour 106 cellules). Une fois le milieu retiré, les cellules ont été rincées deux fois avec du PBS et fixées avec du formaldéhyde à 4% dans du PBS à température ambiante pendant 10 min. Le DAPI a été utilisé pour colorer le noyau cellulaire suivi d'un lavage avec du PBS trois fois. Les cellules ont été examinées au microscope à fluorescence confocal LSM 710 (Zeiss). Les images numériques ont été capturées et traitées avec le logiciel Image J (NIH).

Toutes les expériences sur les animaux ont été évaluées et approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université Stony Brook (IACUC). Toutes les études animales ont été réalisées conformément aux directives du protocole approuvé IACUC et conformément aux directives ARRIVE.

24 souris femelles NOD.Cg-Prkdcscid/J (souris SCID) et 12 souris femelles Babl/C ont été commandées au Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Pour le modèle de transplantation allogénique, les cellules 4T1 ont été récoltées à partir de 3 plaques et lavées avec du PBS. Ensuite, 20 k cellules par souris de suspensions cellulaires ont été injectées dans la deuxième (comptez à partir du bas) pat de graisse mammaire avec une petite incision pour établir un nodule tumoral unique au site d'injection. Après 3 jours de croissance, les cellules 4T1 se sont implantées dans le coussinet adipeux mammaire et ont formé une tumeur solide de 15 à 25 mm3. Ensuite, les souris ont été divisées en deux groupes : le groupe L-PEG2000 et le groupe L-PEG2000-DBCO, qui ont reçu la formulation liposomale par injection IV, respectivement. L'intensité du signal tumoral, le poids corporel et les conditions de vie des souris ont été enregistrés avec des points de temps désignés après l'administration des liposomes. Le deuxième cycle d'injection a été administré 96 h après la première administration de liposomes.

Pour les modèles de transplantation xénogénique, les cellules MCF-7, MDA-MB-231 et MDA-MB-436 ont été récoltées à partir de 12 plaques et lavées avec du PBS. Ensuite, 50 cellules k par souris de suspensions cellulaires ont été injectées dans l'épaule droite par voie sous-cutanée pour construire les modèles xénogéniques de cancer du sein. La taille de la tumeur a atteint environ 100 mm3 après 7 à 10 jours pour le MDA-MB-231, 15 à 20 jours pour le MDA-MB-36 et 25 à 30 jours pour le MCF-7, respectivement. Ensuite, les différents groupes de modèles de cancer du sein ont été injectés avec le même volume de L-PEG2000) ou L-PEG2000-DBCO.

L'imagerie in vivo et ex vivo a été réalisée à l'aide du système IVIS Lumina III (Perkin Elmer). En bref, pour s'assurer que l'intensité de fluorescence est au même niveau, 3 × 100 μL des solutions L-PEG2000 et L-PEG2000-DBCO ont été placés séparément dans des plaques à 96 puits avant administration et balayage sous DiR proche infrarouge déposé via les paramètres suivants : filtre d'excitation 740 nm, filtre d'émission 790 nm, binning 4 ou 8, f/Stop 2. Ces souris ayant reçu les différents liposomes ont été scannées de manière non invasive trois fois sous anesthésie (isoflurane 2% via le vaporisateur de l'instrument IVIS). Après l'analyse in vivo, les souris ont été immédiatement sacrifiées. Les organes (tumeur, foie, cœur, poumon, rate, cerveau, rein, intestin grêle et côlon) ont été collectés et les images ont été acquises en utilisant les mêmes paramètres que ceux décrits ci-dessus. Les images collectées ont été analysées à l'aide du logiciel Living Image 4.3.1 (Perkin Elmer) : les retours sur investissement ont été conçus afin de sélectionner de manière appropriée chaque organe et l'efficacité radiante calculée.

Les souris porteuses de tumeurs ont reçu une injection des liposomes L-PEG2000 et L-PEG2000-DBCO avec 2 % de composants DiI, respectivement. Après 24 h d'administration de liposomes, les tumeurs et les foies sont récoltés et congelés dans un réfrigérateur à - 80 ° C. Les échantillons congelés ont ensuite été coupés en sections (10 μm) avec un cryostat (CM3050 S, Leica, Allemagne). Les sections ont été colorées avec du DAPI, puis scellées avec de l'huile de montage, puis observées à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser (Zeiss, LSM 710).

Toutes les expériences quantitatives ont été réalisées en triple et les résultats ont été exprimés en moyenne ± écart type, sauf indication contraire. L'analyse statistique des données a été réalisée par une analyse de variance à deux voies (ANOVA) avec le post-test de Tukey. Les différences entre les groupes à un niveau de p < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives (*représentées) et celles à p < 0,01 comme hautement significatives (**représentées).

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié [et ses fichiers d'informations supplémentaires].

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Les auteurs tiennent à remercier le Stony Brook Cancer Center pour le soutien de démarrage fourni au Turkman Lab. De plus, la recherche rapportée dans cette publication a été financée en partie par le Lynn November Charity Fund (Turkman).

Stony Brook Cancer Center, Stony Brook, Long Island, États-Unis

Daxing Liu, Jules Cohen et Nashaat Turkman

Département de radiologie et de cancérologie, Renaissance School of Medicine, Stony Brook University, 100 Nicolls Road, Stony Brook, NY, 11794, États-Unis

Daxing Liu et Nashaat Turkman

Division d'hématologie/oncologie, Département de médecine, École de médecine, Université Stony Brook, Long Island, NY, États-Unis

Jules Cohen

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Tous les auteurs ont examiné le manuscrit et contribué à la conception de l'étude, à l'analyse des données et à la rédaction du manuscrit. DL a réalisé les expériences.

Correspondance à Nashaat Turkman.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Liu, D., Cohen, J. & Turkman, N. Le revêtement de surface PEG2000-DBCO augmente l'absorption intracellulaire des liposomes par les xénogreffes du cancer du sein. Sci Rep 12, 10564 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14947-8

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Reçu : 03 avril 2022

Accepté : 15 juin 2022

Publié: 22 juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-14947-8

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