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Jul 24, 2023

Comparaison un à un de la cellule

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 6394 (2023) Citer cet article

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Avec plus de 20 médicaments modifiés au poly (éthylène glycol) (PEG) approuvés par la Food and Drug Administration (FDA) sur le marché, le PEG est le polymère de référence en matière de bioconjugaison. Le couplage améliore la stabilité, l'efficacité et peut prolonger le temps de circulation sanguine des protéines thérapeutiques. Même si la PEGylation est décrite comme non toxique et non immunogène, les rapports s'accumulent avec des données montrant des réactions allergiques au PEG. Étant donné que le PEG n'est pas seulement utilisé en thérapeutique, mais peut également être trouvé dans les aliments et les cosmétiques, des anticorps anti-PEG peuvent apparaître même sans traitement médical. L'hypersensibilité au PEG peut ainsi entraîner une efficacité réduite du médicament, une clairance sanguine rapide et, dans de rares cas, des réactions anaphylactiques. Par conséquent, trouver des alternatives au PEG est crucial. Dans cette étude, nous présentons le polyglycérol linéaire (LPG) pour la bioconjugaison comme polymère alternatif au PEG. Nous rapportons la conjugaison du LPG et du PEG par clic-chimie à la glycoprotéine érythropoïétine (EPO), synthétisée dans un système de synthèse de protéines acellulaires eucaryotes. De plus, l'influence des polymères sur la stabilité et l'activité des EPO sur une lignée cellulaire dépendante de l'hormone de croissance a été évaluée. Les caractéristiques similaires des deux bioconjugués montrent que la LPGylation peut être une alternative prometteuse à la PEGylation.

L'EPO est connue comme l'hormone qui régule la production de nouveaux globules rouges. La plupart des publications récentes traitent de nouvelles découvertes sur le mécanisme d'action de l'EPO sur l'érythrocytose1, l'AVC ischémique2, l'anémie3, l'hypoxie4, l'angiogenèse tumorale5 et les maladies neurodégénératives6. Les variants d'EPO génétiquement modifiés attirent particulièrement l'attention. Les agents stimulant l'érythropoïétine (ESA) ont été continuellement améliorés en commençant par l'érythropoïétine alpha et bêta vers des variantes avec des demi-vies plus longues telles que la darbepoetin alfa7 et l'EPO pégylée (PEG-EPO8). Le PEG-EPO est connu pour stimuler plus efficacement l'érythropoïèse à un intervalle de dosage prolongé9. L'EPO pégylée (Mircera®) a obtenu l'approbation de la Food and Drug Administration (FDA) en 2007 et est prescrite contre l'anémie associée aux maladies rénales10,11. Fort du succès de l'EPO PEGylée et d'autres biopharmaceutiques, le marché mondial des médicaments PEGylés devrait atteindre 10,5 milliards de dollars américains en 202412. Néanmoins, un problème essentiel se pose avec les biopharmaceutiques PEGylés : les anticorps dirigés contre le PEG. Le PEG est considéré comme un polymère biocompatible non toxique et non immunogène qui est attaché à plus de 20 médicaments à base de protéines approuvés par la FDA13. De plus, les thérapeutiques non protéiques telles que les vaccins à ARNm contiennent des nanoparticules pégylées14. Les protéines, les enzymes, les peptides et les nanoparticules modifiés au PEG se caractérisent par une solubilité dans l'eau et une stabilité protéolytique améliorées, ce qui se traduit par une demi-vie prolongée15. Bien que des progrès significatifs aient été réalisés, les systèmes PEGylés ont encore certaines limites qui peuvent limiter leur utilisation généralisée. Ces limitations incluent le développement d'anticorps anti-PEG après utilisation répétée de substances PEGylées, réduisant leur efficacité thérapeutique, et dans des cas spécifiques, des réactions allergiques sévères comme l'anaphylaxie16. Une étude de Yang et al. identifié des anticorps anti-PEG dans 72 % des échantillons contemporains en utilisant un dosage immuno-enzymatique compétitif et quantitatif17. Fait intéressant, ils ont reconnu que 50 % des échantillons de sérum des années 1970 à 1990 possédaient également des anticorps anti-PEG. Grâce à des dosages nouveaux et plus sensibles, la détection d'anticorps anti-PEG et les réactions immunogènes associées se produisent plus fréquemment. En outre, l'utilisation de produits quotidiens tels que les cosmétiques, les savons et les médicaments contenant également du PEG pourrait également avoir un impact sur la présence d'anticorps anti-PEG préexistants18,19. Par conséquent, il est essentiel de repenser la manipulation des médicaments PEGylés en commençant par une détection fiable des anticorps anti-PEG et une adaptation précise des thérapies avec des molécules PEGylées. De plus, de nombreux polymères naturels et synthétiques ont été étudiés pour remplacer le PEG pour l'extension de la demi-vie20,21,22,23. Dans ce contexte, le polyglycérol linéaire (LPG) représente un candidat prometteur en raison de sa structure et de ses caractéristiques similaires au PEG24. Le LPG et le PEG possèdent tous deux un squelette polyéther, bien que le LPG porte un groupe hydroxyle sur chaque unité répétitive, ce qui permet l'introduction de fragments d'immobilisation, de ciblage et de marquage25,26. Le GPL est hautement biocompatible et les esters d'oligoglycérols avec jusqu'à 10 unités répétitives ont été approuvés par la FDA en tant qu'additifs pharmaceutiques et alimentaires et sont disponibles dans le commerce depuis quelques décennies27,28. Le LPG a récemment été conjugué avec succès à diverses protéines modèles via différentes chimies de conjugaison, y compris la conjugaison aléatoire à l'albumine sérique bovine29, la conjugaison site-spécifique via la cycloaddition d'azide-alcyne catalysée par le cuivre (CuAAC) à l'exénatide, la conjugaison N-terminale à l'interleukine30 et Anakinra31 et conjugaison spécifique au site via la cycloaddition azide-alcyne favorisée par la souche (SPAAC) à l'interféron-α-2a32,33.

Bien que le couplage de PEG de poids moléculaires différents à l'EPO ait été fortement évalué au cours des deux dernières décennies, seuls quelques rapports démontrent l'utilisation de polymères alternatifs. De plus, la chaîne peptidique était souvent modifiée, entraînant une suppression des sites de glycosylation et la chimie de conjugaison était limitée à N- ou C-terminal34. Par exemple, un peptide mimétique de l'érythropoïétine a été couplé à un hydroxyéthylamidon biodégradable, renforçant l'effet biologique35. Souvent, ces couplages sont basés sur des processus chimiques avec des conditions difficiles. Dans notre étude, nous présentons pour la première fois une comparaison de différents polymères qui ont été couplés par une réaction de clic biorthogonal dans des conditions douces à une EPO avec les trois sites de N-glycosylation intacts. De plus, en utilisant la synthèse protéique acellulaire, différents conjugués d'EPO ont été synthétisés en très peu de temps, permettant ainsi l'analyse de diverses constructions en parallèle. Par conséquent, nous avons synthétisé à la fois l'EPO PEGylée et LPGylée spécifique au site et étudié leur influence sur l'activité de l'EPO sur la lignée cellulaire dépendante de l'hormone de croissance TF-1. Nous avons choisi la lignée cellulaire TF-1 en raison de la présence du récepteur hEPO endogène. Cette lignée cellulaire est connue pour proliférer en présence d'un facteur de croissance hématopoïétique actif tel que le facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF), différentes interleukines et l'EPO. Nous avons comparé ces bioconjugués LPG et PEG avec Mircera® commercialisé et analysé la stabilité de chaque EPO dans le sérum humain. À cette fin, l'EPO a été synthétisée dans un système sans cellule, comme indiqué précédemment36. Les lysats traductionnels actifs contiennent des vésicules membranaires endogènes dérivées de l'ER, appelées microsomes, qui permettent une translocation dans la lumière et une modification post-traductionnelle ultérieure telle que la glycosylation et le pontage disulfure37, deux conditions préalables indispensables à l'activité de l'EPO. Etant donné qu'aucune O-glycosylation n'est possible dans les systèmes acellulaires, cette position a été choisie pour le couplage des polymères PEG et LPG. Par conséquent, un codon stop ambre a été introduit dans la séquence du gène. L'ajout d'un ARNt suppresseur approprié et d'une aminoacyl-ARNt synthétase modifiée à la réaction acellulaire a conduit à l'incorporation d'une p-azido-l-phénylalanine (AzF) dans la chaîne polypeptidique naissante36. Le groupe azido a ensuite été utilisé pour cliquer sur le PEG et le LPG modifiés par le cyclooctyne via SPAAC, ce qui a donné de l'EPO modifiée de manière spécifique au site. Notre étude montre que les conjugués EPO LPGylés présentent une activité comparable à leurs homologues PEGylés en culture cellulaire et sont stables pendant plus de 24 h.

Des solvants anhydres (diméthylformamide et toluène), des tubes de dialyse en cellulose benzoylée (2 kDa, largeur 32 mm), ont été achetés chez Merck (Darmstadt, Allemagne). Le bromure de tétra-n-octylammonium à 98 % a été acheté chez ACROS Organics et utilisé tel que reçu. Tous les autres produits chimiques ont été achetés auprès de Merck (Darmstadt, Allemagne) sauf indication contraire. 10 kDa α-méthoxy-ω-amino-poly (éthylène glycol) (PEG-NH2) (Rapp POLYMERE, Tübingen, Allemagne) ont été utilisés tels que reçus. Les spectres RMN 1H ont été enregistrés sur un Bruker AMX 500 (Bruker Corporation) ou JEOL ECP 500 (JEOL GmbH). Les déplacements chimiques (δ) sont rapportés en ppm via le pic de solvant deutéré comme standard. Les mesures IR ont été effectuées sur un Nicolet AVATAR 320 FT_IR 5 SXC (Thermo Fisher Scientific) avec une plage de détection de 4 000 à 650/cm. Les mesures de chromatographie par perméation de gel (GPC) dans l'eau ont été effectuées avec un Agilent 1100 équipé d'un injecteur automatique, d'une isopump et d'un réfractomètre différentiel Agilent 1100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). La colonne PSS Suprema (pré-colonne), 1 × avec une taille de pores de 30 Å, 2 × avec une taille de pores de 1000 Å (toutes avec une taille de particules de 10 μm), a été calibrée par rapport aux normes Pullulan avant les mesures. Les mesures GPC dans le tétrahydrofurane (THF) ont été réalisées avec un Agilent SECurity (série 1200), équipé d'un injecteur automatique, d'une pompe isopump et d'un détecteur UV et RI. La séparation a été effectuée via un gel de photoluminescence d'Agilent (1 × pré-colonne, 3 × Mixed-C avec une taille de particule de 5 μm), qui a été calibré par rapport aux standards de polystyrène.

La protection acétal du glycidol, sa polymérisation et la modification de l'extrémité de la chaîne ont été réalisées sur la base de procédures précédemment rapportées par us32. En résumé, dans un ballon Schlenck séché à la flamme (Oct) 4NBr (268 mg, 0,480 mmol, 0,008 eq), a été séché sous atmosphère d'argon. Ensuite, il a été dissous dans 60 ml de toluène sec à température ambiante avant l'ajout d'éther éthoxyéthylglycidylique (EEGE) (10 ml, 65,6 mmol, 1 éq). Le mélange a été refroidi dans un bain de glace et i-Bu3Al (2,1 ml, 2,4 mmol, 0,036 eq) a été ajouté rapidement sous agitation à grande vitesse. La réaction a été laissée se dérouler pendant une nuit à température ambiante et a été désactivée par addition de 1 ml d'éthanol. Le produit brut a été purifié par dialyse contre de l'acétone (MWCO : 2000 g/mol). Le produit a été obtenu sous forme d'huile jaune clair (GPC dans THF : Mn : 20687, © : 1,12). Pour l'élimination des groupes acétal, le polymère a été dissous dans de l'éthanol (0,1 g/mL) et du HCl (3 % v/v d'éthanol) pendant au moins deux heures avant la dialyse dans l'eau (MWCO : 1000 g/mol). Le produit a été obtenu sous la forme d'une huile incolore (eau GPC : Mn : 11885, Đ : 1,19). Ensuite, le polymère déprotégé (1 g, 0,08 mmol, 1 éq) a été dissous dans 5 mL de DMF sec et chauffé à 80 °C sous reflux avant l'ajout de NaN3 (30 mg, 0,4 mmol, 5 éq) au mélange. La réaction s'est déroulée à cette température pendant 3 jours et purifiée par dialyse dans l'eau (MWCO : 1000 g/mol). La modification réussie a été observée par spectroscopie IR (2100/cm de pic d'azide). Le groupe azide a été réduit en amine en dissolvant le LPG-N3 (1 eq) dans de l'eau (0,05 g/mL). Ensuite, du TCEP (1,5 eq aux groupes N3) a été ajouté à la solution. La réaction a été contrôlée par spectroscopie IR jusqu'à ce que la bande respective de N3 disparaisse. Après cela, la purification a été effectuée par dialyse dans l'eau (MWCO : 1000 g/mol). Le LPG-NH2 (1 eq) a ensuite été dissous dans du DMF sec (32 mg/mL), puis de l'Et3N (3 eq) et du BCN-NHS (1,5 eq) ont été ajoutés au mélange. La réaction a été agitée pendant une nuit et purifiée par dialyse contre de l'eau (MWCO : 1000 g/mol). Comme le BCN modifié au GPL est sujet à la réticulation à l'état sec, la conversion complète à ce stade est supposée. La qualité du LPG-BCN a été contrôlée par le spectre 1HNMR (Fig. 1 supplémentaire). Basé sur la mesure GPC dans l'eau, le GPL a un MW de 11,8 kDa.

La modification du PEG-NH2 commercial a été effectuée selon la procédure décrite ci-dessus pour le LPG-NH2. La qualité du PEG-BCN a été contrôlée par le spectre 1HNMR (Fig. 2 supplémentaire). Basé sur la mesure GPC dans l'eau, le PEG a un MW de 10 kDa.

La séquence génique codant pour la séquence de l'érythropoïétine (Uniprot P01588) a été modifiée pour la synthèse protéique acellulaire et la suppression de l'ambre. Par conséquent, la matrice d'ADN a été modifiée comme indiqué précédemment38. De plus, la séquence signal native a été remplacée par une séquence signal de mélittine (aaattcttagtcaacgttgcccttgtttttatggtcgtatacatttcttacatctatgcggac). Une deuxième construction a été conçue en remplaçant le codon 153 (site de O-glycosylation) par un codon stop ambre. Les séquences ont été fabriquées par synthèse de novo (Biocat GmbH, Allemagne) et ligaturées dans le squelette du vecteur pUC57-1.8k.

L'aminoacyl-ARNt synthétase (eAzFRS) et l'ARNt suppresseur ont été fabriqués comme décrit en détail dans Zemella et al. 201939. Brièvement, l'aminoacyl-ARNt synthétase a été synthétisée dans le "RTS500 ProteoMaster E. coli HY Kit" (Biotechrabbit GmbH, Allemagne), purifiée via Strep-Tag, concentrée et stockée à − 80 °C dans un tampon de stockage synthétase (50 HEPES mM, KOAc 10 mM, MgCl2 1 mM, DTT 4 mM, NaN3 0,02 %, pH 7,6).

L'ADN matrice pour l'ARNt suppresseur a été généré à l'aide d'une réaction PCR avec une paire d'amorces O-méthyle spécifique, suivie d'une transcription de ruissellement. L'ARNt a été purifié par extraction au phénol-chloroforme à l'aide du réactif TRIzol (ThermoFisher Scientific), précipité avec de l'isopropanol et remis en suspension dans de l'eau ultra-pure. L'ARNt a été plié dans un cycleur PCR (Biometra TRIO, Analytik Jena) et stocké à - 80 ° C.

La synthèse protéique acellulaire était basée sur des lysats traductionnels dérivés de cellules cultivées de Spodoptera frugiperda 21 (Sf21). La préparation du lysat a été effectuée comme décrit précédemment40,41. La matrice d'ADN (60 ng/µL) a été ajoutée à un mélange réactionnel composé de 20 % (v/v) de lysat, 100 µM d'acides aminés, de sels, de composants énergétiques et de PolyG (10 µM, biomères, Allemagne). Un protocole détaillé de la réaction est décrit dans38,42. Pour surveiller le rendement en protéines via le comptage par scintillation et l'intégrité des protéines via SDS-PAGE suivi d'une autoradiographie, de la leucine 14C uniformément marquée radioactivement (fc 30 µM, Perkin Elmer, Allemagne) a été ajoutée à la réaction. La 14C-leucine est statistiquement incorporée dans la protéine synthétisée de novo. Pour l'incorporation de l'acide aminé non canonique, 2 mM de p-azido-l-phénylalanine, 3 µM d'eAzFRS et 5 µM d'ARNt suppresseur ont été ajoutés. L'intégration réussie a été contrôlée par autoradiographie. En détail, une réaction de transcription-traduction couplée utilisant le plasmide contenant un codon stop ambre a été réalisée en présence et en l'absence de synthétase orthogonale eAzFRS. La réaction de synthèse en l'absence d'eAzFRS donne un motif de bande correspondant à l'EPO tronquée à l'acide aminé 153. Cette EPO tronquée possède toujours les trois N-glycosylations. La réaction de synthèse en présence d'eAzFRS se traduit par un motif de bande correspondant à l'EPO pleine longueur avec trois N-glycosylations. Une différence de motif de bande - en particulier un déplacement du poids moléculaire apparent de l'EPO en présence de la synthétase vérifie l'incorporation d'AzF. De plus, l'incorporation d'AzF a été précédemment montrée par le couplage spécifique d'un colorant phosphine réactif à l'azide à l'EPO36.

Les réactions ont été incubées pendant 3 h à 27 °C, 500 tr/min, recouvertes d'une feuille d'aluminium.

Étant donné que l'EPO est transloquée dans la lumière des vésicules microsomales, la protéine a dû être libérée. Par conséquent, les microsomes ont été centrifugés à 16 000 × g pendant 10 min à 4 ° C, et le culot a été remis en suspension dans du PBS avec le détergent n-Dodecyl-β-Maltoside (0,2% DDM, Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA) , agité 45 min à 1000 rpm et centrifugé à nouveau. Le surnageant a été transféré dans un tube Eppendorf vide et utilisé pour le couplage des polymères PEG et LPG et pour l'analyse de stabilité ainsi que pour les essais de culture cellulaire.

Les polymères ont été dissous dans l'eau à une concentration de 5 à 10 mM. 10 ng d'EPO produite sans cellules ont été incubées avec 5 mM de BCN-PEG et BCN-LPG dans un tube Eppendorf pendant une nuit à 4 ° C. Le couplage des polymères a été contrôlé par un déplacement de l'EPO en autoradiographie.

Les N-glycosylations de l'EPO modifiée et non modifiée ont été clivées par la PNGase F (NEB, USA). Le dosage a été réalisé selon le protocole du fabricant.

Le rendement en protéines de l'EPO synthétisée acellulaire a été déterminé par précipitation à l'acide trichloracétique chaud (TCA, Carl Roth GmbH, Allemagne) suivie d'un comptage par scintillation liquide43.

Les échantillons d'EPO ont été précipités dans de l'acétone froide, séchés et resolubilisés dans un tampon d'échantillon LDS (tampon d'échantillon NuPAGE LDS, Thermo Fisher Scientific). Les échantillons ont été chargés sur des gels SDS-PAGE prémoulés (NuPAGE, 10 % Bis-Tris, Thermo Fisher Scientific) et séparés pendant 40 min à 180 V. Les gels ont été lavés à l'eau, colorés avec une simple coloration bleue sûre (Thermo Fisher Scientific) et lavés encore. Ensuite, les gels ont été séchés pendant 60 min à 70 ° C (Unigeldryer 3545D, Allemagne). Les gels ont été exposés à des écrans phosphorescents pendant 48 h. Les bandes ont été visualisées par imagerie au phosphore (Amersham Typhoon RGB, GE Healthcare).

Des cellules TF-1 (Leibnitz-Institut DSMZ, Allemagne, DSMZ-No. ACC-334) exprimant le récepteur hEPO ont été cultivées dans 85% RPMI-1640 (PAN Biotech), 13% FCS (Biochrom), 1% pyruvate de sodium (Biowest ), 1 % de pénicilline-streptomycine (PAN Biotech) et 5 ng/mL de GM-CSF (PeproTech, Allemagne). Les cellules ont été incubées à 37 ° C et 5% de CO2 dans des flacons T25 et T75 dans un incubateur à CO2 (Binder, Allemagne). La densité cellulaire a été maintenue entre 2 et 7 × 105 cellules/mL. Pour le test d'activité, 2,0 x 105 cellules ont été transférées dans du milieu frais sans GM-CSF. Chaque variant d'EPO (EPO recombinante synthétisée sans cellule (Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA, #E5546-50 UG), Mircera® (Roche, Bâle, Suisse, 0,3 ml)) et GM-CSF ont été ajoutés avec une concentration finale de 10 ng/mL. Un volume égal d'un contrôle sans matrice (NTC) a été ajouté comme contrôle négatif. La croissance cellulaire a été suivie pendant une semaine par coloration au bleu trypan dans une chambre de comptage Luna (Logos biosystems). Le dosage a été effectué en triple et pour chaque échantillon, deux mesures ont été effectuées, résultant en six aliquotes comptées pour chaque échantillon.

L'EPO a été synthétisée comme décrit ci-dessus et couplée au PEG et au LPG. L'EPO modifiée et non modifiée a été incubée avec du sérum humain (SeraCon II, HiSS Diagnostics, Allemagne) pendant 24 h maximum. Après 0, 2, 4, 8 et 24 h, une aliquote a été prélevée et immédiatement congelée par de l'azote liquide. Les aliquotes ont été précipitées dans de l'acétone et chargées sur une SDS-PAGE. L'intégrité des bandes protéiques a été analysée par autoradiographie.

Un schéma général de la synthèse et de la modification des extrémités de chaîne du LPG et du PEG avec le couplage suivant à l'EPO synthétisée acellulaire est illustré à la Fig. 1.

Schéma général de la synthèse et de la modification des extrémités de chaîne du LPG et du PEG avec le couplage suivant à l'EPO synthétisée acellulaire. Structure EPO obtenue à partir de l'entrée APB 1BUY44.

La synthèse protéique acellulaire de l'EPO a entraîné un motif de bande distinct avec quatre bandes définies (Fig. 2A). Ces bandes correspondent aux trois N-glycosylations de l'EPO (glycosylée en un, deux ou trois sites) et à la forme non glycosylée de l'EPO. L'O-glycosylation supplémentaire de l'EPO n'est pas abordée lors de la synthèse protéique acellulaire. Par conséquent, l'acide aminé non canonique a été placé sur la position de la O-glycosylation. L'introduction de l'acide aminé non canonique p-azido-l-phénylalanine (AzF) à la position de O-glycosylation n'a pas modifié le schéma de glycosylation de l'EPO (azido-EPO, voie 3). La glyco-digestion de la PNGase F pour les deux échantillons a entraîné une bande inférieure au poids moléculaire attendu de l'EPO non glycosylée (pistes 2 et 4). Sans synthétase orthogonale appliquée pendant la synthèse acellulaire, aucune EPO pleine longueur n'a été visualisée dans l'autoradiographie (piste 5). De plus, le produit de terminaison glycosylé a été détecté. Après incubation avec la PNGase F, seul le produit de terminaison déglycosylé a été détecté (piste 6).

Couplage chimiosélectif de l'érythropoïétine avec LPG-BCN et PEG-BCN. (A) Autoradiographie de différentes variantes d'EPO : voie 1 et 2 pleine longueur EPO sans acide aminé non canonique, voie 3 et 4 produit de suppression avec p-azido-L-phénylalanine incorporée, voie 5 et 6 produit de terminaison terminé à l'ambre codon d'arrêt. Chaque variante a été analysée en absence (pistes 1, 3, 5) et en présence (pistes 2, 4, 6) de la glycosidase PNGase F. L'incorporation réussie d'AzF a conduit à un motif de bande comparable à celui observé pour l'EPO pleine longueur sans non- acide aminé canonique. La synthèse de l'EPO (avec le codon d'arrêt ambre) en l'absence d'eAzFRS a conduit à un motif de bande à un poids moléculaire réduit comme prévu pour le produit tronqué. (B) Autoradiographie après couplage de LPG-BCN et PEG-BCN à l'EPO. Les voies 1 à 4 et la voie 9 montrent le couplage de LPG-BCN à AzF contenant de l'EPO (voies 1 à 2), de l'EPO terminée (voies 3 à 4) et de l'EPO pleine longueur (voies 9) en l'absence (voies 1 et 3) et présence (pistes 2, 4, 9) de PNGase F. Le couplage réussi de LPG-BCN à AzF contenant de l'EPO se traduit par un déplacement des bandes correspondantes de l'EPO vers un poids moléculaire plus élevé (pistes 1 et 2) à environ 50–60 kDa. Les voies 5 à 8 et la voie 10 montrent le couplage de PEG-BCN à AzF contenant de l'EPO (voies 5 à 6), de l'EPO terminée (voies 7 à 8) et de l'EPO pleine longueur (voies 10) en l'absence (voies 5 et 7) et présence (pistes 6, 8, 10) de PNGase F. Le couplage réussi de PEG-BCN à AzF contenant de l'EPO se traduit par un déplacement des bandes correspondantes de l'EPO vers un poids moléculaire plus élevé (pistes 5 et 6) à environ 40–48 kDa. Les images d'autoradiographie non recadrées sont incluses dans les informations supplémentaires.

Étant donné que l'incorporation d'AzF a été vérifiée dans une première étape, l'azido-EPO a été incubé avec du PEG et du LPG modifiés par BCN pour obtenir le bioconjugué spécifique au site (Fig. 2B). L'incubation d'azido-EPO avec LPG-BCN a entraîné un motif de bande plus faible au poids moléculaire attendu pour l'EPO non couplée. Des frottis et des bandes moléculaires supplémentaires et plus élevés sont visibles, indiquant un couplage réussi du polymère (Fig. 2B, voie 1). Cette hypothèse est vérifiée par l'incubation du LPG-BCN avec l'EPO tronquée résultant de la terminaison au codon stop ambre. Ici, aucune bande supplémentaire n'était visible au-dessus du produit de terminaison pour LPG-BCN (piste 3). La glyco-digestion du LPG-EPO a entraîné un déplacement du frottis vers un poids moléculaire inférieur, indiquant que l'EPO glycosylée a été couplée avec succès au LPG-BCN (piste 2).

Un résultat similaire a été obtenu pour l'incubation d'azido-EPO avec du PEG-BCN. Ici, des bandes définies à un poids moléculaire plus élevé sont visibles, vérifiant le couplage du PEG-BCN à l'azido-EPO (piste 5). Encore une fois, après la digestion de la PNGase F, la bande proéminente s'est déplacée vers un poids moléculaire apparent inférieur, indiquant que l'azido-EPO glycosylé a été couplé avec succès au PEG-BCN (piste 6). Contrairement au LPG-BCN, un couplage légèrement non spécifique au produit de terminaison du PEG-BCN est détecté par autoradiographie (piste 7). Ceci est encore plus visible par incubation d'EPO déglycosylée (sans groupe azido) avec les polymères (pistes 4 et 8). Ici, aucun couplage n'est attendu puisqu'aucun AzF n'est présent dans l'EPO traduite. Par conséquent, un motif de bande comparable à celui de la voie 5 de la Fig. 1 doit être visible sur l'autoradiographie. En effet, le même motif de bande est visible en présence de GPL. En revanche, une légère bande supplémentaire en présence de PEG est une indication visible d'une légère liaison non spécifique du PEG à l'EPO tronquée. Un couplage non spécifique comparable de PEG-BCN à l'EPO pleine longueur sans AzF incorporé a également été détecté (piste 10). Aucun couplage non spécifique de LPG-BCN à l'EPO pleine longueur sans AzF incorporé n'a été observé (piste 9). Des contrôles supplémentaires ont révélé les résultats attendus (Fig. 3 supplémentaire) confirmant l'intégration d'AzF et le couplage ultérieur de chaque polymère. Néanmoins, un mélange d'EPO couplée au LPG et d'EPO non couplée a été obtenu pour l'analyse des cultures cellulaires. Sur la base de l'autoradiographie, environ 50 à 70 % de l'échantillon contient de l'EPO couplée au GPL, tandis que les 30 à 50 % restants sont composés d'EPO non couplée. Étant donné que le couplage du PEG à l'EPO a entraîné une efficacité de près de 100 %, nous estimons que le pourcentage d'EPO couplée au PEG pour les tests de culture cellulaire est d'environ 90 %. Les 10 % restants sont composés d'EPO non couplée et de PEG-EPO couplée non spécifique.

Pour la détermination de l'activité des variants individuels de l'EPO, une lignée cellulaire dépendante de l'hormone de croissance (cellules TF-1) a été cultivée en présence et en l'absence d'EPO modifiée et non modifiée (figures 3 et 4). Le test d'activité a montré que chaque échantillon contenant de l'EPO entraînait une croissance de cellules comparable à l'EPO disponible dans le commerce. L'effet le plus élevé a été observé après l'ajout de PEG-EPO (Fig. 3). L'effet était encore plus élevé par rapport à l'EPO non modifiée et à l'EPO pégylée disponible dans le commerce (Mircera®). Comme prévu, les contrôles (pas de contrôle matrice et produit de terminaison) n'ont montré aucune activité ou seulement une activité limitée (produit de terminaison). Fait intéressant, l'EPO modifiée au PEG et l'EPO non modifiée ont montré des courbes de croissance presque comparables jusqu'au jour 4. La courbe de croissance de l'EPO non modifiée a atteint son maximum après 4 jours, tandis que le pic de l'EPO modifiée au PEG a été calculé après 5 jours. De plus, les cellules incubées avec de l'EPO modifiée au PEG ont montré une courbe de croissance prolongée.

Analyse de l'activité cellulaire de l'EPO synthétisée sans cellules modifiée par PEG et non modifiée. Courbes de croissance de la lignée cellulaire TF-1 complétée par de l'EPO modifiée au PEG (ligne continue), de l'EPO non modifiée (ligne pointillée), du produit de terminaison (ligne pointillée unique) sans cellule de contrôle de matrice (NTC, pointillé- pointillés), EPO commercial (ligne pointillée) et Mircera® commercial (ligne pointillée grise). Les concentrations de variants d'EPO synthétisés acellulaires ont été déterminées par précipitation au TCA. 10 ng/mL de chaque échantillon ont été ajoutés aux cellules TF-1 cultivées dans une plaque à 24 puits. Les cellules ont été comptées pendant 6 jours. Les données sont présentées sous forme d'écart type de trois expériences indépendantes mesurées en double (n = 3).

Analyse de l'activité cellulaire de l'EPO synthétisée sans cellules modifiée par LPG et non modifiée. Courbes de croissance de la lignée cellulaire TF-1 complétée par de l'EPO modifiée par LPG (ligne continue), de l'EPO non modifiée (ligne pointillée), du produit de terminaison (ligne pointillée unique) sans cellule de contrôle de matrice (NTC, pointillé- pointillés), EPO commercial (ligne pointillée) et Mircera® commercial (ligne pointillée grise). Les concentrations de variants d'EPO synthétisés acellulaires ont été déterminées par précipitation au TCA. 10 ng/mL de chaque échantillon ont été ajoutés aux cellules TF-1 cultivées dans une plaque à 24 puits. Les cellules ont été comptées pendant 6 jours. Les données sont présentées sous forme d'écart type de trois expériences indépendantes mesurées en double (n = 3).

Un effet comparable a été observé après l'ajout de LPG-EPO et des contrôles correspondants (Fig. 4). Le taux de croissance le plus élevé a été déterminé après l'ajout d'EPO commerciale résultant en une densité cellulaire maximale de 7 × 105 cellules/mL. Encore une fois, l'effet du LPG-EPO avec une densité cellulaire maximale de 6,2 × 105 cellules/mL était comparable à l'EPO commerciale. De manière frappante, le maximum de cellules comptées après l'ajout de LPG-EPO était en accord avec le PEG-EPO aux jours 4 et 5. L'effet du LPG-EPO était encore plus élevé par rapport à l'ajout de PEG-EPO. Encore une fois, l'ajout d'EPO non modifiée synthétisée sans cellule a entraîné une densité cellulaire maximale au jour 4 avec 5, 5 × 105 cellules / ml.

Les résultats attendus ont été détectés pour les contrôles : les cellules meurent rapidement en présence de produit de terminaison et de NTC. Des contrôles supplémentaires n'ont révélé aucun effet des polymères sur la culture cellulaire (Fig. 4 supplémentaire).

L'effet du LPG et du PEG conjugués sur la stabilité de l'EPO a ensuite été analysé par un test de stabilité sérique (Fig. 5). Les variants d'EPO modifiés et non modifiés ont été incubés pendant 24 h dans du sérum humain. Des échantillons ont été prélevés à des moments prédéterminés. L'intégrité des protéines a été analysée par autoradiographie. L'EPO non modifiée (pleine longueur et avec un acide aminé non canonique) a montré le motif de bande caractéristique composé d'EPO non glycosylée et d'EPO supplémentaire qui est glycosylée sur jusqu'à trois sites. Le PEG-EPO n'a montré qu'une seule bande à un poids moléculaire plus élevé que l'EPO, correspondant à la protéine couplée au polymère. Aucune protéine non couplée n'a été détectée. Le LPG-EPO a de nouveau montré un frottis au-dessus de la bande de PEG-EPO. De légères bandes pour l'EPO non couplée sont visibles. La conjugaison du PEG et du LPG n'a montré aucune influence significative sur la stabilité sérique des EPO, car tous les bioconjugués ont montré un motif de bande comparable même après 24 h d'incubation dans le sérum humain.

Analyse de stabilité de l'EPO modifiée et non modifiée. L'EPO pleine longueur non modifiée, l'EPO non modifiée contenant un acide aminé non canonique (ncaa), l'EPO modifiée au PEG et modifiée au LPG ont été incubées jusqu'à 24 h dans du sérum humain. Ensuite, les échantillons ont été précipités à l'acétone et analysés via SDS-PAGE avec l'autoradiographie suivante. Aucun changement dans le motif de bande n'a été observé après 24 h indiquant des échantillons d'EPO stables. Les images d'autoradiographie non recadrées sont incluses dans les informations supplémentaires.

Le poly (éthylène glycol) (PEG) a été le "gold standard" pour améliorer les caractéristiques des protéines telles que la stabilité, la solubilité et l'immunogénicité. Une large gamme de structures de PEG différentes ont été fabriquées au cours des 30 dernières années, allant des petits poids moléculaires (550 Da) aux gros polymères linéaires et ramifiés (> 8 000 000 Da)45. Alors qu'en 1992, seules sept structures différentes de PEG dans les produits cosmétiques étaient détectées46, ce nombre est passé à plus de 340 structures différentes de PEG en 201547. L'utilisation fréquente du PEG est également liée au comportement inerte et non immunogène du PEG. Néanmoins, des rapports récents montrent que des anticorps anti-PEG peuvent apparaître après injection de liposomes pégylés, de protéines48,49 et après contact avec des produits cosmétiques contenant du PEG. En particulier, plusieurs chaînes courtes de PEG (< 10 kDa) attachées à des protéines ont une probabilité plus élevée d'induire des anticorps anti-PEG50,51. Une étude récente a analysé l'impact des anticorps IgM et IgG anti-PEG préexistants sur l'efficacité thérapeutique de l'EPO52 pégylée. A cet effet, un modèle de souris avec des anticorps monoclonaux anti-PEG pré-injectés a été établi avant l'administration de PEG-EPO. En conséquence, la capacité du PEG-EPO à induire la production de nouveaux globules rouges a été bloquée par les anticorps anti-PEG en raison de l'accumulation de PEG-EPO dans le foie et la rate. L'activité biologique du PEG-EPO a été récupérée en augmentant la concentration initiale. Par conséquent, la dose appropriée de PEG-EPO doit être évaluée en fonction d'une mesure des anticorps anti-PEG préexistants chez les patients individuels. Alternativement, de nouvelles biomolécules qui ont une fonction similaire à celle du PEG pourraient contourner les problèmes actuels avec les anticorps anti-PEG.

Parallèlement, des polymères synthétiques alternatifs tels que les poly(glycérols), les poly(oxazolines), le poly(méthacrylate d'hydroxypropyle), le poly(méthacrylate de 2-hydroxyéthyle), le poly(N-(2-hydroxypropyl)méthacrylamide), le poly(vinylpyrrolidone), le poly(N ,N-diméthylacrylamide), et la poly(N-acryloylmorpholine) ont été étudiées pour remplacer le PEG53,54. Chacun des polymères présente des avantages uniques tels que la non-immunogénicité, une hydrophilie élevée, une bonne biocompatibilité mais aussi des inconvénients tels que l'accumulation, la non-biodégradabilité et des coûts de synthèse en partie élevés55. Par conséquent, les polymères doivent être évalués en détail pour obtenir des informations sur les caractéristiques de chaque protéine et son impact possible sur le corps humain.

En raison des caractéristiques structurelles du polyglycérol linéaire (LPG), il propose un candidat prometteur pour la conjugaison aux protéines. Dans une étude comparant les liposomes PEG- et LPGylés, Abu Lila et al. ont observé que contrairement aux liposomes pégylés, la modification avec du LPG améliore les performances in vivo du système. Les liposomes LPGylés n'ont pas induit de clairance sanguine accélérée (ABC), une limitation des liposomes PEGylés lors d'administrations répétées, ce qui peut influencer négativement l'activité pharmaceutique56.

Imran Ul-haq et al. ont comparé le PEG et le LPG dans des contextes in vitro et in vivo. Ils ont montré que le LPG a une viscosité intrinsèque 25 fois plus petite que le PEG lorsqu'on compare des molécules de même taille. Cette caractéristique est d'une grande importance dans les formulations où des concentrations plus élevées sont requises. De plus, des études basées sur des tests d'agrégation et d'hémolyse des globules rouges (RBC) ont observé que le LPG n'induisait aucune agrégation de RBC même à des concentrations de 10 mg/mL, tandis que le PEG induisait une agrégation massive de RBC à cette concentration57. Cela a également été observé auparavant pour les PEG et LPG58 de plus faible poids moléculaire.

La synthèse protéique acellulaire a été choisie pour analyser les caractéristiques fondamentales des polymères à base de PEG et de LPG, telles que l'impact sur la stabilité et l'intégrité des protéines, ainsi que l'influence sur les cellules humaines en culture. La synthèse et la modification réussies de l'EPO dans des systèmes de synthèse de protéines acellulaires ont été démontrées précédemment36. Contrairement à l'étude de 2018, nous avons maintenant analysé l'effet des polymères couplés sur les caractéristiques des EPO. Fait intéressant, les deux polymères ont montré des comportements différents après le processus de couplage. Après conjugaison des polymères, un déplacement proéminent vers un poids moléculaire plus élevé était visible sur le SDS-PAGE. En effet, la migration du gel semblait différente entre les deux polymères même si le LPG-BCN et le PEG-BCN ont un poids moléculaire similaire de 10 kDa. Cet effet peut être expliqué par des interactions spécifiques des polymères au sein du SDS-PAGE comme décrit précédemment pour le PEG59. De plus, un effet comparable a également été observé après couplage de LPG-BCN et PEG-BCN à l'interleukine-431 humaine. En plus de la migration modifiée du gel, la bioconjugaison du LPG et du PEG a montré une efficacité de couplage différente. Pour le PEG-BCN, une efficacité de couplage de 90 à 95 % et pour le LPG-BCN, une efficacité de couplage de 50 % est estimée. Ces différences peuvent se produire en raison de profils d'interaction protéine-polymère spécifiques. Dans le cas du PEG-BCN, des lysines et des arginines chargées positivement sont décrites, tandis que le LPG a été trouvé à proximité des sérines et des méthionines32. La proportion de lysines et d'arginines est beaucoup plus élevée dans l'EPO par rapport aux méthionines et aux sérines. Indépendamment, l'efficacité de couplage était suffisante pour les deux polymères conduisant à un signal spécifique déterminé par autoradiographie. Par conséquent, l'effet de l'EPO non modifiée et modifiée sur la culture cellulaire a été déterminé. Les courbes de croissance ont montré les résultats attendus puisque les cellules ne se sont développées qu'en présence de variants d'EPO. Néanmoins, des différences entre les variantes de l'EPO étaient visibles. Au cours des trois premiers jours, la croissance des cellules lors de la stimulation par le PEG- et le LPG-EPO non modifiés était presque identique. Après le jour 4, la croissance des cellules incubées avec de l'EPO non modifiée s'est arrêtée tandis que les cellules incubées avec les deux EPO modifiées ont continué à croître. Cela indique une activité prolongée de l'EPO modifiée par un polymère. Ces résultats sont en accord avec les effets positifs décrits des variants d'EPO conjugués à un polymère7,8.

Les données obtenues à partir du test de stabilité sont également en accord avec les résultats précédents. Une étude précédente a collecté des échantillons de sérum et de plasma contenant de l'EPO et a stocké ces échantillons pendant 14 jours dans différentes conditions. Même l'échantillon stocké à température ambiante contenait de l'EPO immunoréactive après 14 jours60.

Étant donné que la synthèse de protéines acellulaires peut être effectuée à l'échelle du µL au litre et que la synthèse de protéines pharmaceutiquement pertinentes telles que l'EPO est généralement effectuée en quelques heures, le système offre un excellent choix pour le criblage d'alternatives PEG couplées au pré- positions définies dans l'EPO humaine.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié (et ses fichiers d'informations supplémentaires).

Polyéthylène glycol)

Polyglycérol linéaire

Érythropoïétine

Cycloaddition d'alcyne-azide catalysée par le cuivre

Cycloaddition azoture-alcyne favorisée par la souche

Bicyclo[6.1.0]non-4-yne

Tyrosyl-ARNt-synthétase d'E. coli améliorée et modifiée

P-azido-l-phénylalanine

Spodoptera frugiperda

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Pour la préparation du lysat Sf21, les auteurs tiennent à remercier D. Wenzel et Dipl. Ing. (FH) DA Wüstenhagen (Fraunhofer IZI-BB, Potsdam-Golm, Allemagne).

Financement Open Access activé et organisé par Projekt DEAL. Cette recherche a été financée par le ministère des Sciences, de la Recherche et de la Culture (MWFK, Brandebourg, Allemagne), le projet PZ-Syn (numéro de projet F241-03-FhG/005/001) et le ministère fédéral de l'Éducation et de la Recherche (BMBF, Allemagne), projet CEFOX (031B0831) et projet Next-PEG (13XP5049A).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Paria Pouyan, Anne Zemella, Rainer Haag et Stefan Kubick.

Institut de chimie et de biochimie, Université libre de Berlin, Takustr. 3, 14195, Berlin, Allemagne

Paria Pouyan et Rainer Haag

Institut Fraunhofer de thérapie cellulaire et d'immunologie (IZI), Branch Bioanalytics and Bioprocesses (IZI-BB), Am Mühlenberg 13, 14476, Potsdam, Allemagne

Anne Zemella, Jeffrey L. Schloßhauer, Ruben M. Walter et Stefan Kubick

Institut de chimie et de biochimie-biochimie, Université libre de Berlin, Takustr. 6, 14195, Berlin, Allemagne

Jeffrey L. Schloßhauer & Stefan Kubick

Institut de biotechnologie, Université technique de Berlin, Gustav-Meyer-Allee 25, 13355, Berlin, Allemagne

Ruben M. Walter

Faculté des sciences de la santé, Faculté commune de l'Université de technologie de Brandebourg Cottbus-Senftenberg, de la faculté de médecine de Brandebourg Theodor Fontane et de l'Université de Potsdam, Potsdam, Allemagne

Stefan Kubick

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PP : conceptualisation, conservation des données, analyse formelle, investigation, méthodologie, validation, visualisation, rédaction ; AZ : conceptualisation, conservation des données, analyse formelle, enquête, méthodologie, validation, visualisation, rédaction ; JLS : conservation des données, révision ; RMW : conservation des données, révision, SK : conceptualisation, acquisition de financement, administration de projet, ressources, supervision, validation, révision, édition, RH : conceptualisation, acquisition de financement, administration de projet, ressources, supervision, validation, révision, édition

Correspondance avec Anne Zemella ou Rainer Haag.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Pouyan, P., Zemella, A., Schloßhauer, JL et al. Comparaison un à un des conjugués d'érythropoïétine synthétisés acellulaires modifiés avec du polyglycérol linéaire et du polyéthylène glycol. Sci Rep 13, 6394 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33463-x

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Reçu : 25 janvier 2023

Accepté : 13 avril 2023

Publié: 19 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-33463-x

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