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Jun 05, 2023

Efflux de Ca2+ facilité par le co

Volume Biologie des communications

Communications Biology volume 6, Article number: 573 (2023) Citer cet article

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Ca2+ est un important messager de signalisation. Dans les micro-organismes, les champignons et les plantes, les antiporteurs H+/Ca2+ (CAX) sont connus pour jouer un rôle clé dans l'homéostasie du Ca2+ intracellulaire en catalysant son efflux à travers la membrane cellulaire. Ici, nous révélons que l'homologue bactérien de la CAX, YfkE, transporte le Ca2+ selon deux modes distincts : un mode d'échange H+/Ca2+ à faible flux et un mode à haut flux dans lequel Ca2+ et les ions phosphate sont co-transportés (1:1) en échange de H+. Le couplage avec le phosphate accélère fortement l'activité d'efflux de Ca2+ de YfkE. Nos études révèlent que le Ca2+ et le phosphate se lient aux sites adjacents dans une voie de translocation centrale et conduisent à des connaissances mécanistes qui expliquent comment ce CAX modifie ses motifs de répétition alpha conservés pour adopter le phosphate comme « chaperon de transport » spécifique pour la translocation du Ca2+. Cette découverte révèle un mécanisme de co-transport au sein de la famille CAX qui indique que cette classe de protéines contribue à l'homéostasie cellulaire du Ca2+ et du phosphate.

Les ions calcium sont parmi les ions métalliques les plus abondants dans la nature et sont cruciaux pour de nombreuses fonctions importantes dans les cellules, où Ca2+ sert de messager polyvalent1,2. Les signaux de Ca2+ sont généralement initiés par l'influx de Ca2+ dans le cytoplasme via des canaux membranaires sélectifs et sont encore augmentés par l'efflux de Ca2+ des organites intracellulaires tels que le réticulum endoplasmique. Des niveaux élevés et soutenus de Ca2+ cytosolique sont cependant mortels. Les antiporteurs calcium-cation (CaCA) sont essentiels pour restaurer l'homéostasie du Ca2+. Cette famille de transporteurs membranaires, qui comprend les antiporteurs H+/Ca2+ (CAX) et les échangeurs Na+/Ca2+ (NCX), séquestre et exporte activement le Ca2+ hors du cytosol, alimenté par l'afflux de H+ ou Na+ vers le bas des gradients électrochimiques transmembranaires3,4.

Les CAX sont omniprésents dans les bactéries, les champignons et les plantes3. Par exemple, trois homologues de CAX, appelés CAX1-3, ont été identifiés chez Arabidopsis, et plus d'une vingtaine d'autres chez les pommiers3,5. Dans les cellules végétales, les protéines CAX sont présentes à la fois dans les membranes plasmatiques et tonoplastiques et facilitent le mouvement du Ca2+ cytosolique hors de la cellule ou dans les vacuoles acides, en réponse à divers stimuli, notamment le froid, la salinité et les changements de pH du sol5,6, 7,8. Les homologues de CAX sont également omniprésents dans les micro-organismes, bien que leurs rôles physiologiques nécessitent une enquête plus approfondie. Le Ca2+ est impliqué dans un large éventail de processus bactériens, notamment la chimiotaxie, la division cellulaire et la sporulation 9. La signalisation du Ca2+ a également été impliquée dans l'infection bactérienne et les interactions hôte-pathogène10. Les protéines CAX sont susceptibles de jouer un rôle central dans ces processus, car elles semblent être les principaux systèmes d'efflux de Ca2+ chez les bactéries. Par conséquent, l'élucidation du mécanisme de transport de CAX aidera à comprendre comment ces organismes maintiennent l'équilibre du Ca2+ en réponse aux perturbations et à la signalisation du Ca2+.

Structurellement, toutes les protéines CAX semblent partager une architecture de base commune, composée de onze hélices transmembranaires (TM). Deux motifs de séquence conservés, appelés répétitions a, se trouvent dans les hélices TM2-3 et TM7-8 et semblent fournir des sites pour la reconnaissance de H+ et Ca2+. Les structures aux rayons X ont récemment commencé à révéler la base moléculaire du mécanisme de cette classe d'antiporteurs, à savoir ceux de YfkE de Bacillus subtilis, VCX1 de Saccharomyces cerevisiae et CAX_Af d'Archaeoglobus fulgidus11,12,13. Ces structures suggèrent un mécanisme dans lequel les hélices TM2-3 et TM7-8 adoptent des arrangements distincts qui exposent alternativement les sites de reconnaissance pour H+ et Ca2+ de chaque côté de la membrane. Ces trois structures capturent cependant un état similaire dans le mécanisme d'accès alterné, à savoir celui qui est ouvert vers l'intérieur (c'est-à-dire vers le cytosol), dans lequel deux résidus de glutamate conservés importants pour l'activité d'échange H+/Ca2+ sont adjacents dans un ion central -site de liaison. Ces deux résidus carboxylate coordonnent un ion Ca2+ dans la structure VCX111. Que les structures de YfkE et CAX_Af capturent un état sans ligand ou lié à H+ n'était pas immédiatement apparent, bien que les deux résidus carboxylate (E72 et E255 dans YfkE) adoptent des conformations différentes par rapport à l'état lié à Ca2+ de VCX1. Récemment, nos études sur YfkE ont également révélé que son mécanisme d'accès alterné est régulé de manière allostérique par la liaison de Ca2+ à un mini-capteur de Ca2+ intracellulaire12.

Ici, nous révélons un type de mécanisme de transport Ca2+ pour YfkE, et peut-être d'autres membres de la famille CAX. Nous démontrons que YfkE dispose d'un mode de transport dans lequel Ca2+ et le phosphate inorganique (Pi) sont co-transloqués dans un rapport 1:1, en échange de H+. Le couplage à Pi transforme YfkE d'un antiport à faible flux à un antiport à haut flux. Pour mieux comprendre ce mécanisme de co-transport Ca2 + -Pi, nous utilisons plusieurs approches biochimiques et biophysiques ainsi que des simulations informatiques et une modélisation moléculaire basée sur l'expérience. Nos résultats nous amènent à conclure que Ca2+ et Pi se lient à un site de reconnaissance partagé à l'intérieur du transporteur, qui comprend E72 et E255 ainsi que d'autres résidus polaires à proximité. E72 et E255 peuvent cependant lier H+ à la place, ce qui explique la capacité de YfkE à exploiter le gradient H+ pour piloter le transport de Ca2+ et Pi. Nos résultats nous permettent également de rationaliser pourquoi la translocation des anions Pi accélère la réaction d'échange Ca2+/H+.

Pi est un nutriment important et abondant dans les cellules pour la synthèse des nucléotides, de l'énergie et des phospholipides. Nous fournissons un exemple qu'une protéine de transport facilite simultanément la translocation membranaire de Ca2+ et Pi. Nos résultats révèlent non seulement un mode de transport unique au sein de la famille CAX, mais suggèrent également son rôle physiologique dans l'homéostasie du Ca2+ et du phosphate dans les cellules.

Pour commencer à caractériser YfkE, nous avons mesuré son activité de transport de Ca2+ en utilisant des vésicules à l'envers, après qu'un gradient de H+ vers l'extérieur a été établi en ajoutant du NADH, qui active le pompage de H+ dans les vésicules par la chaîne de transport d'électrons. Comme prévu, l'évolution temporelle résultante a montré que le Ca2+ était transporté dans les vésicules YfkE (Fig. 1a). L'activité de transport observée correspondait bien au modèle cinétique de Michaelis – Menten, donnant KM = 69 µM et Vmax = 4,2 µmol/min/g (Fig. 1b). De manière frappante, l'ajout de phosphate inorganique 5 mM (Pi) à la solution externe (c'est-à-dire le côté intracellulaire de la vésicule) a fortement accéléré l'activité de transport de Ca 2 + de YfkE par huit fois (Fig. 1a). Plus précisément, l'analyse cinétique a révélé KM = 198,7 µM et Vmax = 33,3 µmol/min/g (Fig. 1b). En revanche, nous n'avons observé aucun effet pour les analogues de Pi tels que le nitrate, le sulfate, l'arséniate et le vanadate (Fig. 1 supplémentaire), ou pour l'ATP (Fig. 2 supplémentaire), indiquant que l'accélération du transport de Ca2+ par YfkE est spécifiquement médiée par Pi . Il convient de noter que Ca(H2PO4)2, la principale forme de composés de phosphate de calcium à pH neutre, est très soluble dans les solutions aqueuses. De manière constante, nous n'avons observé aucune accumulation de Ca2+ dans les vésicules témoins dépourvues d'YfkE même en présence de Pi (Fig. 1a), ce qui exclut que Ca2+ et Pi puissent former un précipité. Ces résultats indiquent que YfkE exploite la disponibilité de Pi cytosolique pour réguler à la hausse son activité antiport H+/Ca2+.

a Essais de transport de 45Ca2+ (+/− Pi) mesurés à l'aide de vésicules à l'envers. Les vésicules ont été mélangées avec 5 mM de Pi avant d'ajouter 0,5 mM de 45CaCl2 pour déclencher les réactions à température ambiante. Des vésicules vides ont été utilisées comme contrôle. b Analyse cinétique du transport Ca2+ de YfkE (+/-5 mM Pi). Les données ont été soustraites avec les vésicules de contrôle respectives, puis intégrées à la cinétique de Michalis – Menten à l'aide de GraphPad 9. Les barres d'erreur représentent les écarts types (n = 3).

Ces observations nous ont conduit à émettre l'hypothèse que Pi stimule l'activité de YfkE car Ca2+ et Pi sont co-transportés. Bien qu'à notre connaissance, le transport de Pi n'ait pas été observé pour d'autres antiporteurs CAX, le co-transport d'un cation et de Pi a été rapporté pour d'autres familles de protéines. Par exemple, le symporteur Na+/Pi SLC34 utilise un gradient de Na+ pour piloter l'absorption de Pi14. Pour tester cette hypothèse, nous avons mesuré le transport de Pi en utilisant le 32P-phosphate de potassium comme substrat. Comme le montre la figure 2a, Pi a été importé dans les vésicules YfkE de manière dépendante du temps. Conformément aux tests de transport de Ca2+ (Fig. 1a), l'absorption de Pi n'a été observée qu'en présence de Ca2+ (+0,5 mM) et aucun afflux n'a été détecté en l'absence de Ca2+ (Fig. 2a). De même, aucune absorption de Pi n'a été détectée dans les vésicules témoins dépourvues d'YfkE, que ce soit en présence ou en l'absence de Ca2+ (Fig. 2a). Ces résultats ont soulevé l'hypothèse que YfkE catalyse le co-transport de Ca2+ et Pi.

a Évolution dans le temps du transport Pi de YfkE mesuré à l'aide de vésicules à l'envers (+/− 0,5 mM Ca2+). Un substrat de 32Pi 5 mM a été ajouté à la réaction. Des vésicules vides ont été utilisées comme contrôle. b Image SDS-PAGE colorée au Coomassie de la protéine YfkE purifiée. c Évaluation de l'orientation de YfkE dans les protéoliposomes traités à la thrombine. L'immunoblot a été développé en utilisant un anticorps anti-His. d Les essais de transport de 32Pi ont été mesurés à l'aide de protéoliposomes reconstitués, montrant que YfkE importe Pi en présence de Ca2+ 0,5 mM, et non en présence d'EDTA 2 mM. Les barres d'erreur représentent les écarts-types (n = 3).

Les dosages de vésicules décrits ci-dessus démontrent que YfkE est nécessaire pour le co-transport de Ca2+ et Pi, puisque cette activité n'a pas été observée non plus dans les vésicules témoins dépourvues de YfkE (Figs. 1a et 2a). Pour vérifier que YfkE seul médie cette activité sans que d'autres protéines de transport d'ions soient impliquées, nous avons purifié YfkE et l'avons reconstitué en protéoliposomes (Fig. 2b, c et Fig. 3 supplémentaire). L'orientation de YfkE dans ces protéoliposomes est susceptible d'être du côté droit, évaluée par une protéolyse limitée, car la thrombine supprimerait l'étiquette His N-terminale de YfkE sur la surface intracellulaire (Fig. 2c et Fig. 3 supplémentaires). Pour initier la réaction de transport, un gradient de pH vers l'extérieur a été établi en diluant les protéoliposomes (pH 7, 4) dans un tampon à pH plus élevé (pH 8), et l'absorption de Pi couplée à H + a été mesurée à l'aide de P32-phosphate. Les résultats ont clairement montré que YfkE importe Pi dans les protéoliposomes en présence de Ca2+ 0,5 mM, mais pas en l'absence de Ca2+ (+2 mM EDTA) (Fig. 2d). Ces résultats valident nos dosages de vésicules et confirment en outre que YfkE seul co-transporte Ca2+/Pi à travers la membrane en échange de H+.

Conformément au mécanisme de co-transport, l'activité de transport Pi de YfkE WT a été significativement réduite lorsque la concentration de Ca2+ a été réduite de 0,5 mM (Fig. 2a) à 0,1 mM de Ca2+ (Fig. 3a). La comparaison des vitesses de transport observées pour chaque espèce dans les mêmes vésicules indique que la stoechiométrie de ce couplage est de 1 Ca2+:1 Pi (Fig. 3b, c). Comparée à Ca2+, cependant, l'affinité de liaison apparente de Pi est beaucoup plus faible (KM = 4,9 mM), d'après l'analyse de la cinétique de transport (Fig. 3d et Tableau 1). La liaison au substrat Pi a également été démontrée à l'aide d'un test de liaison au 32Pi radiomarqué. Les résultats ont montré la liaison de Pi à la protéine YfkE WT, mais elle a été perturbée par la mutation de E72A et E255A (Fig. 3e). La liaison de Pi a été en outre caractérisée par calorimétrie de titrage isotherme (ITC), donnant une affinité de liaison d'environ 1 mM (Fig. 3f) en ligne avec la valeur KM générée à partir de l'analyse cinétique de transport (Fig. 3d). Avec les tests de transport ci-dessus, toutes ces caractérisations in vitro confirment collectivement que Pi est bien un substrat de co-transport de YfkE.

a Les tests de transport de 32Pi ont été mesurés à l'aide de vésicules à l'envers, ne montrant aucune activité de E72A (carrés rouges) et E255A contrairement à WT. Les dosages ont été effectués en présence de Ca2+ 0,1 mM. b Taux de transport Ca2+ ou Pi mesurés dans les mêmes vésicules YfkE aux points de temps indiqués. c Stœchiométrie de Ca2+ vs Pi en comparant leurs taux de transport (b). d Pi cinétique de transport de YfkE (+0,1 mM Ca2+) dans les conditions de pH cytosolique indiquées. Les données ont été soustraites avec le contrôle (-) puis intégrées à la cinétique de Michalis – Menten pour calculer KM et Vmax à l'aide de GraphPad 9. e Test de liaison radiomarquée au 32Pi utilisant la protéine YfkE purifiée de type sauvage, E72A et E255A immobilisées sur des billes de Ni-NTA . f Analyse ITC de la liaison de Pi à YfkE. Pi 10 mM a été titré dans une solution de protéine YfkE. L'ajustement du modèle cinétique à l'aide du logiciel Origin donne une affinité de liaison de 0,93 ± 0,36 mM. g Paramètres cinétiques de transport Pi (KM et Vmax) de YfkE mesurés au pH indiqué. Les barres d'erreur représentent les écarts-types (n = 3 pour (a, d, e, g); n = 4 pour (b, c)).

Ensemble, ces données nous amènent à conclure que YfkE catalyse l'efflux de Ca2+ en utilisant deux modes ou mécanismes différents : un mode lent, lorsque Pi est absent ou largement indisponible ; et un mode rapide, lorsque le Pi intracellulaire est suffisamment abondant, qui implique le co-transport de Ca2+ et de Pi. Fait important, dans les deux cas, le transport de Ca2+ nécessite un contre-transport de H+, dans son gradient électrochimique, conformément au modèle d'accès alterné. En conséquence, l'ajout de l'ionophore H + carbonyl cyanure m-chlorophényl hydrazone (CCCP) à nos tests de transport a complètement abrogé l'absorption de Ca2 + dans les vésicules à l'envers, en l'absence ou en présence de Pi (Fig. 2 supplémentaire).

En solution, Pi peut exister dans différents états d'ionisation en fonction du pH. En particulier, l'équilibre entre H2PO41- mono-anionique et HPO42- di-anionique a un pKa de 7,2. Pour évaluer quelle espèce de Pi est la plus susceptible d'être co-transportée avec Ca2+ par YfkE, nous avons mesuré l'absorption de Pi dans des vésicules à l'envers en faisant varier le pH externe, c'est-à-dire en faisant varier l'amplitude du gradient de H+ vers l'extérieur, mais aussi le Pi équilibres d'ionisation. Comme prévu, l'absorption de Pi s'est accélérée à mesure que le pH externe est passé de 6, 5 à 7, 5, reflétant probablement une force motrice plus forte provenant de l'efflux descendant de H + (Fig. 3g). A des valeurs de pH plus élevées, cependant, le transport était clairement inhibé, de manière progressive, indiquant que YfkE ne peut pas reconnaître Pi di-anionique mais plutôt H2PO41- mono-anionique.

Contrairement au Ca2+, il n'y a pas de définition claire d'un motif de liaison prototypique de Pi dans les structures protéiques. Cependant, il est connu que la liaison de Pi est favorisée par des résidus chargés positivement (arginine et lysine) et des résidus polaires tels que la thréonine, la sérine et l'histidine15. Le site de reconnaissance Ca2+ à l'intérieur de YfkE, formé par E72, E255 et les résidus polaires environnants, est la seule région adaptée à la reconnaissance de Pi dans le domaine transmembranaire de la protéine (Fig. 4a supplémentaire)12. Les tentatives d'identification d'une voie alternative pour la translocation de Pi, par exemple, médiée par R4 et R46, deux résidus chargés positivement à la surface de la protéine intracellulaire, n'ont entraîné aucune altération de l'activité de transport de Pi (Fig. 4b, c et tableau supplémentaires). 1). Comme mentionné ci-dessus, les tests de liaison de Pi radiomarqués montrent que la mutation des deux résidus connus pour coordonner Ca2+ a également perturbé la liaison de Pi (Fig. 3e), indiquant que ces deux ions se lient à proximité l'un de l'autre, dans un site de reconnaissance partagé au sein de la protéine.

Pour tester davantage cette hypothèse, nous avons développé un test basé sur le transfert d'énergie de résonance de luminescence (LRET). Les mesures LRET rendent compte des changements de distance entre un donneur fluorescent et son accepteur, qui se manifestent par des signaux de luminescence de différentes durées de vie. Grâce à cette approche, nous avons cherché à déterminer si la reconnaissance de Ca2+ et Pi induisait des changements conformationnels comparables sur YfkE. Comme les tests fonctionnels décrits ci-dessus, ces mesures ont été effectuées dans des vésicules à l'envers, pour examiner la protéine dans son environnement membranaire natif (voir « Méthodes » pour plus de détails). Plus précisément, nous avons marqué les positions G56 (boucle TM1-2 intracellulaire) et C3 (amino-terminal) avec du chélate de terbium et Atto-465, respectivement, en utilisant une chimie réactive au thiol (Fig. 4a). Sur la base des résultats LRET, la distance entre le donneur et l'accepteur en l'absence de tout substrat est de 25, 5 ± 0, 2 Å (Fig. 4b). L'ajout de 0,5 mM de Ca2+ ou de 5 mM de Pi aux vésicules a augmenté la distance de manière similaire, à 26,9 ± 0,3 Å. Pour vérifier ce résultat, nous avons introduit le donneur de chélate de terbium en position S202 (dans TM6), tout en conservant l'accepteur Atto-465 en C3 (Fig. 4d). Comme observé pour G56, l'ajout de Ca2+ ou Pi a augmenté la distance entre le donneur et l'accepteur de manière similaire, de 26,3 ± 0,1 Å à 27,7 ± 0,2 ou 28 ± 0,2 Å (Fig. 4e). Il est important de noter que les mutants G56C et S202C ont conservé l'activité d'absorption de Ca2+ en présence de Pi (Fig. 5 supplémentaire). Par conséquent, les changements de distance détectés par LRET reflètent probablement les changements conformationnels des protéines induits par la liaison au substrat. Certes, ces changements sont modestes, en raison d'une position sous-optimale du donneur et de l'accepteur, et il n'est donc pas possible de discerner quels mouvements protéiques sont représentés par ces données. Cependant, ces différences sont statistiquement significatives et spécifiquement induites par Ca2+ ou Pi. En effet, aucun changement n'a été observé lors de l'ajout de sulfate 5 mM, un analogue de Pi (Fig. 4c, f). En conclusion, les mesures LRET soutiennent notre hypothèse selon laquelle Ca2+ et Pi accèdent à un site de reconnaissance commun au sein de la protéine.

a, d Thème de la conception expérimentale LRET pour mesurer la distance (ligne pointillée rouge) entre le donneur (sphère bleue) au N-terminal C3 et le récepteur (sphère rouge) à G56C de TM1 (orange) (a) ou S202C de TM6 ( magenta) (d). Les hélices formant des voies sont colorées en vert ; Le clivage de la thrombine (représenté par des ciseaux) supprime le donneur pour calculer le fond de la membrane brute. Les flèches bleues indiquent les changements de conformation de l'hélice dans la membrane. b, c, e, f Traces LRET après soustraction de l'arrière-plan respectif : forme apo (noir), +0,5 mM Ca2+ (bleu), +5 mM Pi (rouge) et sulfate 5 mM (vert). b, c G56C ; e, f S202C.

Pour donner un contexte structurel à ces mesures biochimiques et biophysiques, nous avons eu recours à la modélisation moléculaire. Plus précisément, nous avons cherché à construire un modèle hypothétique qui pourrait expliquer comment YfkE reconnaît à la fois Ca2+ et Pi d'une manière qui entraîne une compétition avec H+, comme c'est la norme pour un antiporteur d'ions couplés. La première étape de ce processus consistait à déterminer si la structure existante de YfkE12 orienté vers l'intérieur capture un état lié à H+. Si tel est le cas, nous avons estimé que cette structure expérimentale fournirait une bonne base pour modéliser l'état lié à Ca2+ et Pi ; en effet, les données structurelles disponibles pour les antiporteurs membranaires montrent que d'autres formes liées au substrat du même état fonctionnel diffèrent principalement dans la configuration des chaînes latérales formant les sites de liaison au substrat, sans changement majeur dans le squelette protéique.

À cette fin, nous avons effectué une série de simulations de dynamique moléculaire de tous les atomes conçues pour quantifier la probabilité de protonation de chaînes latérales sélectionnées à l'intérieur du transporteur (Fig. 6 supplémentaire). Plus précisément, nous nous sommes concentrés sur E72, E255 et H256, les trois résidus protonables de la voie centrale au sein des répétitions α (Fig. 5a). On avait précédemment prédit que H256 était impliqué dans la liaison H+ puisqu'il est conservé dans les CAX couplés à H+, mais pas dans les NCX12 couplés à Na+. En tant que témoins négatifs, nous avons également sondé E233 et H226, qui sont exposés à la surface de la protéine et ne devraient donc pas s'écarter de manière significative de leurs propensions inhérentes à la protonation en solution, pour un pH donné. Comme résumé dans le tableau 2, nos résultats indiquent fortement que E72 et E255 sont simultanément protonés dans la structure existante orientée vers l'intérieur de YfkE. Lorsque les états protonés et déprotonés sont comparés individuellement, il est très clair que le premier est très fortement favorisé dans la géométrie spécifique capturée dans la structure cristalline, par rapport à ce qui est intrinsèque à ce type de chaîne latérale en solution. (En d'autres termes, le `` pKa apparent '' de E72 et E255 dans cette conformation spécifique est fortement décalé vers le haut.) Cette propension est considérablement plus élevée pour E72 que E255, ce qui suggère que E72 est le dernier site à se déprotoner dans l'état orienté vers l'intérieur . Si E255 est réévalué alors que E72 est protoné (c'est-à-dire non chargé), la probabilité de protonation de E255 est logiquement diminuée, mais elle reste fortement décalée vers le haut. En revanche, la propension à la protonation calculée pour le résidu de surface E233 est très similaire à celle du glutamate libre en solution, que E72 et E255 soient ou non supposés protonés. Ce résultat est celui attendu pour un site non fonctionnel, corroborant la validité de la méthodologie de simulation utilisée ici pour évaluer l'énergétique relative de la protonation.

a Comparaison entre les structures de YfkE protoné (cyan) et de VCX1 lié au Ca2+ (orange), montrant leurs changements conformationnels (flèches noires) de trois résidus titrables (bâtonnets) dans la voie de translocation. Les MT 2 et 7 sont représentés sous forme de dessins animés. Dans VCX1, E106 interagit avec Ca2+ (sphère verte) via les eaux (sphère rouge) par des liaisons H (lignes pointillées noires). Les résidus de VCX1 sont marqués soulignés. b Analyse cinétique de transport 45Ca2+ mesurée à l'aide de vésicules inversées ne montrant aucune activité de E72Q et E255Q contrairement à WT. Les données ont été soustraites avec (-) des vésicules témoins. Les barres d'erreur représentent l'écart type (n = 3). c–e Courbes de titrage isotherme de Ca2+ dans une solution protéique de YfkE WT (c), E255Q (d) et E72Q (e). L'ajustement des données a été réalisé à l'aide du logiciel Origin.

Contrairement à nos découvertes pour E72 et E255, l'examen de H256 en utilisant la même approche indique que cette chaîne latérale est déprotonée dans la conformation de YfkE capturée par la structure cristalline (tableau 2). Même lorsque E72 et E255 sont supposés chargés négativement, ce qui favoriserait en principe une charge positive à H256, nous ne détectons aucun décalage significatif de la probabilité de protonation de H256 par rapport à un analogue de l'histidine en solution, ou par rapport à H226, qui est exposé à la surface des protéines. Lorsque E72 et E255 sont supposés être protonés, la protonation de H256 est encore moins probable; en effet, le H256 déprotoné est clairement favorisé (c'est-à-dire que son « pKa apparent » est décalé vers le bas).

En conclusion, cette analyse indique que la structure cristalline tournée vers l'intérieur de YfkE capture un état lié au substrat, à savoir avec deux H + liés aux sites E72 et E255. H256, cependant, ne se lie pas simultanément à un troisième H+, ce qui suggère que la stoechiométrie antiport de YfkE pourrait être 1Ca2+:2H+. Ces résultats sont cohérents avec l'observation mentionnée ci-dessus selon laquelle la mutation alanine de E72 ou E255 abroge le transport de Ca2+ induit par H+ dans des essais expérimentaux12. En revanche, l'effet de la mutation alanine de H256, bien que significatif, est comparable à celui de la mutation d'autres chaînes latérales polaires non protonables au voisinage des sites de liaison H+, tels que N69A ou Q281A12.

Comme mentionné, des études structurelles d'une protéine CAX de levure, VCX1, auraient détecté un ion Ca2+ lié11. Le site de liaison est formé par deux résidus acides, E109 et E305, qui sont équivalents à E72 et E255 dans YfkE, respectivement. Il semble donc clair que 2 H+ entrent en compétition avec 1 Ca2+ pour se lier à ce site. Cependant, les différentes propensions à la protonation de E72 et E255 suggèrent qu'ils ne sont pas identiques dans ce mécanisme de compétition. En fait, la structure de VCX1 indique également les différents rôles de ces deux résidus carboxylate dans la liaison de Ca2+, c'est-à-dire que E305 (E255 dans YfkE) coordonne directement Ca2+, tandis que E109 (E72 dans YfkE) interagit indirectement avec l'ion via trois molécules d'eau ( Figure 5a)11. Pour mieux comprendre leurs rôles spécifiques dans la liaison Ca2+/H+, nous avons muté E72 et E255 en glutamine, ce qui élimine la déprotonation tandis que la liaison Ca2+ reste possible en principe. Comme prévu, la mutation E72Q ou E255Q a complètement aboli le transport de Ca2+, car la déprotonation des deux chaînes latérales carboxylate est nécessaire pour fermer le cycle antiport (Fig. 5b). Cependant, l'examen de ces deux protéines mutantes à l'aide de l'ITC a confirmé qu'elles avaient des rôles distincts en termes de liaison H+/Ca2+. Le titrage Ca2+ sur WT YfkE a donné une affinité de liaison de 0,46 ± 0,02 µM (Fig. 5c). Aucune saturation n'a été observée pour E255Q dans la plage de titrage, indiquant que le groupe carboxylate E255 est nécessaire pour la liaison Ca2+ (Fig. 5d). À l'opposé, le carboxylate dans E72 semble être dispensable puisque E72Q n'altère pas la liaison Ca2+. Au lieu de cela, la mutation multiplie par trois l'affinité de liaison Ca2+ apparente (Kd = 0,14 ± 0,001 µM) par rapport à WT (Fig. 5e). Pris ensemble, les résultats informatiques et expérimentaux suggèrent que la première étape du mécanisme par lequel YfkE reconnaît Ca2+ à l'état orienté vers l'intérieur est la déprotonation de E255 ; cette étape est nécessaire et suffisante pour la liaison du Ca2+. La déprotonation de E72 se produirait par la suite et serait probablement suivie d'une transition conformationnelle à plus grande échelle vers l'état tourné vers l'extérieur.

De multiples sources de preuves confirment que Ca2+ et Pi sont liés de manière adjacente dans la voie de translocation centrale : premièrement, la mutation des résidus impliqués dans la liaison de Ca2+, c'est-à-dire E72 et E255, non seulement abroge le transport de Pi (Fig. 3a) mais aussi la liaison de Pi ( figure 3e); deuxièmement, Ca2+ et Pi induisent des changements conformationnels similaires tels que mesurés par LRET (Fig. 4) ; et troisièmement, le co-transport de Pi modifie le KM pour Ca2+ (Fig. 1b). Dans la structure de YfkE, plusieurs résidus polaires, dont N69, N99, Q252, Q281 et H256, sont situés à côté de E72 et E255 à proximité du site de liaison de transport12. Bien que ces résidus polaires soient conservés dans la famille CAX (Fig. 7 supplémentaire), ils n'ont aucune interaction directe avec Ca2+ dans la structure à l'état lié au Ca2+ de VCX111. Nous émettons l'hypothèse que ces résidus sont plutôt impliqués dans la liaison de Pi. Pour tester cette hypothèse, nous avons examiné les effets de la mutation alanine de ces résidus polaires à l'aide d'essais de transport Pi (Fig. 6a). Le rôle de chaque résidu dans la liaison de Pi a été évalué par analyse de transport KM (tableau 1). Les changements les plus significatifs de KM ont été trouvés pour Q281A et H256A, montrant une réduction de six ou sept fois par rapport à WT, indiquant un rôle important dans la reconnaissance de Pi. Il convient de noter que ces mutations perturbent également l'absorption de Ca2+12, conformément à notre hypothèse selon laquelle les sites de liaison pour Ca2+ et Pi sont proximaux.

a Essais cinétiques de transport de Pi mesurés à l'aide de vésicules à l'envers : N69A, N99A, N252A, Q281A et H256A. Différentes concentrations (5 × plus élevées que WT) de vésicules ont été utilisées pour les mutants afin d'obtenir des données utiles pour l'analyse cinétique. Les données ont été soustraites avec (-) des vésicules témoins, puis intégrées à la cinétique de Michalis – Menten à l'aide de GraphPad 9. Les barres d'erreur représentent les écarts types (n = 3). b Vue d'ensemble du modèle YfkE vu le long du plan de la membrane ; les deux répétitions à topologie inversée, comprenant chacune cinq hélices transmembranaires, sont colorées en orange (TM1-TM5) et bleu marine (TM6-10). Une hélice transmembranaire (TM0) précède la répétition N-terminale. Les sites de liaison pour Ca2+ (sphère magenta) et Pi (sphères jaune et rouge) sont formés par des résidus dans ce que l'on appelle les répétitions alpha, c'est-à-dire TM2-TM3 et TM7-TM8. c Gros plan sur la structure hypothétique du site de liaison pour Ca2+ et Pi dans YfkE. Les résidus impliqués dans la coordination des ions sont mis en évidence. Le réseau d'interaction proposé est indiqué par des lignes noires. d Identique à c, avec des cartes d'occupation superposées calculées à partir de l'ensemble des modèles générés dans cette étude. Plus précisément, la figure montre un contour des cartes d'occupation à une valeur de 85 %, pour les chaînes latérales protéiques (maille grise), Ca2+ (maille verte) et Pi (maille rouge). Autrement dit, la partie de la structure à l'intérieur des contours est à peu près cohérente sur 85 % de l'ensemble, tandis que la partie à l'extérieur est variable.

Après avoir établi que la structure existante YfkE tournée vers l'intérieur représente un état lié à H +, plutôt qu'une conformation apo, nous avons procédé à la modélisation des changements dans cette structure qui pourraient expliquer comment Ca2 + et Pi mono-anionique sont simultanément reconnus et transportés, après H + sont déchargés. À cette fin, nous avons utilisé une procédure proche de la modélisation d'homologie conventionnelle, adaptée pour ne considérer que les solutions qui satisfont une série de contraintes géométriques reflétant les données biochimiques et fonctionnelles que nous avons obtenues pour cet antiporteur (voir 'Méthodes' pour plus de détails). Le modèle intègre également des informations dérivées d'une enquête de la Protein Data Bank, en particulier d'une protéine de structure connue qui reconnaît également Ca2+ et Pi simultanément, à savoir une hydrolase dépendante de Ca2+ connue sous le nom de PON116. Cette protéine présente une structure en forme de beignet avec un site central où Ca2+ et Pi sont coordonnés, ce qui semble étonnamment similaire au site de liaison dans YfkE et VCX1 (Fig. 8 supplémentaire).

Pour explorer de manière adéquate la gamme de configurations de chaînes latérales compatibles avec les ensembles de contraintes énumérés ci-dessus, nous avons généré un ensemble de 2 000 modèles au total. Nous avons ensuite analysé cet ensemble conformationnel à l'aide d'un algorithme de clustering basé sur la similarité par paires (voir 'Méthodes' pour plus de détails). Le modèle illustré à la Fig. 6b – d est représentatif du cluster le plus peuplé, qui comprend environ 52 % de tous les modèles produits. De par sa conception, le modèle présente des écarts minimes dans la conformation du squelette par rapport à la structure expérimentale de l'état lié à H+. Néanmoins, il semble clair qu'un réarrangement d'un nombre limité de chaînes latérales est suffisant pour produire un modèle non seulement plausible chimiquement mais également cohérent avec les données expérimentales existantes. Plus précisément, Ca2+ est coordonné par des interactions bidentées simultanées avec les groupes carboxylate de E72 et E255 ainsi que par les carbonyles de G68 et N69. Pi est à proximité et est coordonné par plusieurs résidus agissant comme donneurs d'hydrogène, en plus de H256, qui semble prêt à agir comme accepteur. Bien que ce modèle tourné vers l'intérieur soit par définition hypothétique, nous postulons qu'il fournit un contexte structurel plausible à nos données biochimiques et physiologiques et montre que la reconnaissance simultanée de Ca + et Pi sur un site partagé au sein de YfkE est tout à fait réalisable.

Les fluctuations de la concentration cytosolique de Ca2+ sont une stratégie de signalisation cellulaire universelle. La signalisation médiée par le Ca2+ dépend cependant non seulement de l'ampleur des changements de concentration, mais également de la vitesse, de la fréquence et des schémas spatio-temporels spécifiques de ces changements. La génération de ces signaux complexes en réponse à des stimuli nécessite l'action concertée des canaux Ca2+, des transporteurs et des pompes sur la membrane plasmique et les membranes des organites intracellulaires, afin de réguler l'influx et l'efflux de Ca2+9,17. Dans les organismes unicellulaires et les plantes supérieures, les antiporteurs CAX fournissent l'un des principaux mécanismes de maintien de cet équilibre complexe de Ca2+3,18.

Dans cette étude, nous révélons un type de mécanisme de régulation de CAX. Nous avons constaté que l'activité d'échange H+/Ca2+ de l'homologue bactérien CAX YfkE peut être fortement accélérée en présence de Pi. De plus, nos résultats utilisant à la fois des vésicules d'E. coli (Fig. 2a) et des protéolipsomes reconstitués (Fig. 2d) indiquent fortement que YfkE co-transporte Pi avec Ca2+ ; c'est-à-dire que Pi pourrait être considéré comme un "chaperon de transport" qui facilite l'efflux de Ca2+. Sur la base de nos tests de transport, le couplage de Ca2+ et Pi est hautement spécifique (Fig. 1 supplémentaire), mais ces deux ions présentent une affinité distincte, c'est-à-dire que le KM apparent pour Ca2+ est de 0,15 mM (Fig. 1b), tandis que celui de Pi est de 5 mM (Fig. 3c), ce qui est également démontré par les expériences ITC (Fig. 2f). Cette disparité peut être le reflet de leurs différentes concentrations dans les cellules. Le [Ca2+] cytosolique est étroitement contrôlé en dessous de μM9,19, alors que Pi est beaucoup plus abondant, à la fois dans les cellules procaryotes et eucaryotes, à 1–10 mM20,21. L'abondance de Pi cytosolique devrait permettre à YfkE de co-transporter Ca2+ et Pi dans des conditions physiologiques typiques.

Pi n'est pas seulement un composant important dans les métabolismes cellulaires, mais sert également de molécule de signalisation22. Plusieurs systèmes de transport Pi sont disponibles pour faciliter l'homéostasie du phosphate. Dans les bactéries et les levures, des protéines spécifiques de liaison au Pi réagissent aux changements de la disponibilité ambiante du Pi au niveau de la membrane plasmique et transduisent des signaux intracellulaires pour réguler à la hausse l'expression des gènes impliqués dans l'absorption du Pi23,24. Notre découverte que l'activité d'efflux de Ca2+ de YfkE est régulée par la disponibilité de Pi cytosolique soulève l'hypothèse que les protéines CAX sont impliquées dans l'homéostasie de Ca2+ et de Pi, deux ions essentiels dans les cellules. Il a été précédemment suggéré que YfkE est impliqué dans la sporulation chez Bacillus subtilis25. Fait intéressant, l'accumulation de Ca2+ a été trouvée sous forme de sel de phosphate de calcium dans les spores rétrogressives de Bacillus26. Il est possible que YfkE utilise son activité de co-transport Ca/Pi pour réguler ce processus. Toutes ces hypothèses nécessitent des investigations supplémentaires, mais il convient de noter que le co-transport Ca2+-Pi a été décrit à la fois chez les bactéries et les plantes. Rosen et al. ont constaté que l'efflux de Ca2+ dans E. coli est médié par deux systèmes de transport, l'un indépendant de Pi et l'autre dépendant de Pi27. Chez Arabidopsis, la perturbation des transporteurs vacuolaires H+/Ca2+ CAX1 et CAX3 provoque des altérations notables de la teneur en Pi28. Nos analyses biochimiques, biophysiques et informatiques indiquent que YfkE reconnaît Ca2+ et Pi dans un site commun, par des interactions directes ou indirectes avec des résidus conservés parmi de nombreuses protéines CAX, notamment E72, E255, N69, N99, Q252, Q281 et H256 ( Fig. 7 supplémentaire). Par conséquent, il semble plausible que le mécanisme de co-transport que nous observons pour YfkE puisse être une caractéristique commune au sein de la famille CAX.

Alors que le mécanisme de transport de YfkE et d'autres protéines CAX est susceptible d'être décrit avec précision par le modèle d'accès alterné, une confirmation nécessitera des informations structurelles supplémentaires au-delà des états existants orientés vers l'intérieur. Nos analyses fonctionnelles et structurales révèlent un mécanisme de régulation de YfkE activé par la disponibilité de Pi cytosolique. En l'absence ou en faible abondance de Pi, YfkE fonctionne dans un mode d'échange H + / Ca2 + à faible efflux impliquant une compétition ionique pour E72 et E255, les deux résidus carboxylate du site central (Fig. 7a). E72 et E255 sont tous deux fonctionnellement essentiels. Comme indiqué, nos résultats de calcul montrent que YfkE porte le H + transporté à E255 et E72 (tableau 2). Nos expériences ITC (Fig. 5c – e) suggèrent que la liaison initiale du Ca2+ à l'état orienté vers l'intérieur nécessite le déplacement de la liaison H+ à E255 mais pas nécessairement à E72 (Tableau 2). Les deux protons doivent cependant être libérés avant que le transporteur puisse revenir à l'état tourné vers l'extérieur. Il est donc possible que la déprotonation complète du site central suite à la liaison de Ca2+ à une forme partiellement protonée soit un facteur limitant d'un point de vue cinétique.

a YfkE maintient un mode de transport à faible efflux en l'absence de Pi, dans lequel l'accès alterné de H+/Ca2+ déclenche la transition conformationnelle entre les états tourné vers l'intérieur et vers l'extérieur. b La présence (ou l'augmentation) de Pi cytosolique promeut YfkE vers un mode de co-transport H+/Ca-Pi à flux élevé. Dans les deux modes, E72 transfère H+ (sphère verte) à E255 pour dissocier Ca2+ (sphère bleue). En mode co-transport, Pi (sphère rouge) lié entre E255 et H256 adjacent à Ca2+ facilite le renouvellement du transport.

L'élévation du [Pi] cytosolique fait passer le transporteur en mode à flux élevé en couplant l'efflux de Ca2 + au co-transport de Pi, les deux ions étant reconnus de manière adjacente dans le site central de la voie (Fig. 7b) comme suggéré par notre modèle d'amarrage et études mutationnelles (Fig. 6). Le mécanisme par lequel Pi accélère l'efflux de Ca2+ nécessite une étude plus approfondie. Lorsque le Pi cytosolique est suffisamment abondant, le Pi pourrait altérer la thermodynamique de la réaction d'échange H+/Ca2+, qui serait stimulée par le gradient transmembranaire vers l'extérieur de Pi en plus du gradient de H+ vers l'intérieur. Alternativement, ou en plus, la liaison de Pi en plus de Ca2+ pourrait aider à accélérer le déchargement complet de H+ du transporteur, lui permettant ainsi de faire la transition entre les états orientés vers l'intérieur et vers l'extérieur tout en étant lié à Ca2+. Cette hypothèse est étayée par les analyses cinétiques dans lesquelles le couplage de Pi conduit à une forte augmentation de Vmax du Ca2+ transporté de 8x tandis que l'affinité de liaison du Ca2+ transporté (KM) est légèrement réduite. Le Pi lié n'interagit pas directement avec E72, selon notre modèle structurel hypothétique, mais il est proximal à E255 (Fig. 6c, d). Ainsi, il est possible que la libération de H+ de E72 se produise via E255, et que le Pi mono-anionique dessert un site de protonation transitoire entre E255 et H256, qui déchargerait alors le H+ dans le cytosol. Pi accélérerait donc le chiffre d'affaires du transport en accélérant la dissociation complète de H+ de l'état orienté vers l'intérieur. Il convient de noter que la Vmax du transport de Pi culmine à pH 7, 5, ce qui est très proche du pKa (7, 2) de l'équilibre entre les espèces mono-anioniques H2PO41- et di-anioniques HPO42- (Fig. 3g). Fait intéressant, un mécanisme de transfert de H+ médié par Pi (entre deux résidus carboxylate) a également été proposé pour un transporteur H+/phosphate29. Il est donc concevable que ce type de mécanisme de saut H+ soit courant chez les transporteurs couplés au Pi. Malgré la disponibilité de plusieurs structures de CAX11,12,13, la stœchiométrie de H+ vs Ca2+ est insaisissable car sa détermination reste techniquement difficile. Dans cette étude, nous avons constaté que l'activité de transport d'un homologue de CAX est régulée par la présence de Pi, qui est elle-même une espèce protonable. Une caractérisation fine du couplage H+ dans chaque mode de transport sera donc nécessaire pour disséquer l'interaction entre Pi, Ca2+ et H+ dans ce mécanisme d'échange.

YfkE appartient à la superfamille CaCA, qui comprend à ce jour plus de 200 membres dans tous les domaines de la vie18. Tous les homologues de CaCA présentent les deux motifs de séquence connus sous le nom de répétitions α (TM2-3 et TM7-8) avec les deux résidus carboxylate utilisés pour la coordination H+/Na+/Ca2+ (par exemple, E72 et E255 dans YfkE). Ces motifs ne sont cependant pas strictement conservés et les variations de séquence semblent moduler la sélectivité du substrat de différents transporteurs et finalement dicter si l'ion de couplage dans le cycle d'échange est H + ou Na + 11,12,13,30 (Fig. 9 supplémentaire) . Dans YfkE, la protonation de E72 et E255 à l'état tourné vers l'extérieur permet au transporteur d'atteindre la conformation tournée vers l'intérieur, qui peut alors charger le Ca2+ cytosolique (et le Pi). E54 et E213, les deux résidus carboxylate homologues dans l'échangeur Na+/Ca2+ NCX_Mj, peuvent également se lier à H+ à l'état tourné vers l'extérieur, mais le transporteur est alors inhibé31,32 car il ne peut pas accéder à l'état tourné vers l'intérieur33, conformément à la fait que NCX_Mj ne transporte pas H+ 30,33. En revanche, la liaison de Na + facilite cette transition conformationnelle permettant à NCX_Mj d'exploiter le gradient de Na + vers l'intérieur. La correspondance entre les spécifications de transport et de liaison est donc non triviale et nécessite une cartographie de l'énergétique du cycle complet d'accès alterné. De plus, les variations de séquence entraînent également des dépendances ioniques plus complexes. Par exemple, dans les cellules cérébrales, NCKX catalyse le co-transport de K+ et Ca2+ en échange de Na+. Cette dépendance au K+ a été attribuée à un seul résidu d'aspartate dans les deuxièmes répétitions α34. Dans les mitochondries, l'échangeur Na+/Ca2+ NCLX peut également transporter Li+ en échange de Ca2+, et ce mode de transport dépend d'une seule substitution d'acide aminé dans la seconde répétition35. Nos résultats suggèrent que H256, conservé parmi de nombreuses protéines CAX (et également dans la seconde répétition) mais remplacé par la leucine/thréonine dans les échangeurs Na+/Ca2+ (Fig. 9 supplémentaire), est le résidu essentiel qui permet le co-transport Ca2+-Pi dans YfkE. Cette histidine n'est pas présente dans certains CAX procaryotes, par exemple dans ChaA, un homologue de CAX de E. coli, un résidu glycine se trouve à la position équivalente (Fig. 9 supplémentaire). ChaA, cependant, est distinct de YfkE en ce qu'il médie l'efflux de K+ ou Na+ couplé à H+36,37. Ainsi, il semble plausible que l'activité de co-transport Ca2+/Pi puisse être présente dans d'autres homologues de CAX. Quoi qu'il en soit, nos découvertes fournissent des preuves supplémentaires que les protéines CaCA modifient leur sélectivité de substrat en ajustant les motifs de répétition α utilisés pour la reconnaissance du Ca2+, entraînant différents mécanismes d'activation ou de régulation dans différents types de cellules.

Des vésicules à l'envers (ISO) ont été préparées par une méthode d'homogénéisation à basse pression. En bref, des cellules E. coli BL21 (DE3) hébergeant un vecteur pET28a-YfkE ont été cultivées dans un milieu de bouillon Luria à 37 ° C jusqu'à A600 de 0, 4. Des mutations ont été générées en utilisant une approche de mutagenèse dirigée standard et confirmées par séquençage. L'expression des protéines a été induite en ajoutant 0, 2 mM d'isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) pendant 2 h à 25 ° C. Les cellules ont été lavées avec un tampon contenant 10 mM de Tris-HCl pH 7,3, 140 mM de KCl, 0,5 mM de DTT, 250 mM de saccharose. La rupture cellulaire a été traitée par un seul passage à travers un homogénéisateur C3 (Avestin) à basse pression (4000 psi). Après avoir éliminé les débris cellulaires par centrifugation, les surnageants ont été centrifugés à l'aide d'un rotor Ti45 à 40 000 tr/min pendant 1 h pour sédimenter les vésicules membranaires. Les vésicules ont été homogénéisées dans le même tampon puis congelées rapidement dans de l'azote liquide avant utilisation.

Les activités de transport Ca2+ et Pi de YfkE ont été mesurées à l'aide de vésicules à l'envers. Brièvement, les vésicules membranaires ont été diluées dans un tampon (pH 8,0) contenant les mêmes composants. Avant les dosages, un gradient de H + vers l'extérieur a été établi en ajoutant 5 mM de NADH aux vésicules pendant 10 min. Bien qu'il soit possible qu'un petit nombre de vésicules du côté droit soient présentes dans nos échantillons, la chaîne de transport d'électrons dans ces vésicules ne peut pas être activée car le NADH est imperméable à la membrane. Par conséquent, la seule activité mesurée est celle des vésicules à l'envers. Pour mesurer l'activité de transport de Ca2+, du phosphate de potassium froid 5 mM a également été ajouté aux vésicules. Pour mesurer l'activité de transport du phosphate, 0,5 mM de CaCl2 froid a été ajouté à la place. Les essais de transport ont été déclenchés en ajoutant 45Ca2+ ou 32P-Pi (Perkin Elmer) comme indiqué dans les réactions à température ambiante. Les réactions ont été terminées par filtration à travers une membrane de nitrocellulose (0,22 um) sur un collecteur de filtration Millipore puis lavées immédiatement avec un tampon. Les filtres ont été séchés à l'air et comptés dans un compteur à scintillation liquide pour déterminer l'activité de transport. L'analyse cinétique a été réalisée en ajustant les données au modèle exponentiel unique de Michaelis – Menten à l'aide du logiciel Graphpad Prism 9. Pour les dosages de vésicules, des vésicules membranaires préparées avec des cellules BL21 (DE3) hébergeant un vecteur vide ont été utilisées comme contrôle. Pour les dosages cinétiques des mutants, la concentration des vésicules a été ajustée individuellement pour obtenir des données utiles pour l'ajustement du modèle.

Les protéines de YfkE WT et ses variantes ont été exprimées et purifiées en utilisant la même approche. En bref, l'expression des protéines a été réalisée dans la souche E. coli C41 (DE3) dans un milieu d'auto-induction38 à 25 ° C pendant la nuit. Les cellules ont été mises en suspension dans un tampon contenant 20 mM de phosphate de Na, pH 7,4, 500 mM de NaCl et 20 mM d'imidazole, puis rompues par trois passages dans un homogénéisateur C3 (Avestin) à 15 000 psi. Les fractions membranaires ont été collectées comme décrit ci-dessus et mises en suspension dans la lyse. amortir. Les fractions membranaires ont été solubilisées en ajoutant 1 % (p/v) de n-dodécyl-β-maltoside (DDM) à 4 °C pendant 1 h et incubées avec de la résine Ni-NTA (GE Healthcare). Les résines ont été lavées avec un tampon complété avec 60 mM d'imidazole et 0,05 % de DDM, puis éluées avec un tampon complété avec 400 mM d'imidazole et 0,05 % de DDM. La protéine éluée a ensuite été purifiée à l'aide d'une colonne Superdex-200 10/300 GL (GE Healthcare) équilibrée dans un tampon contenant 20 mM HEPES (pH 7,4), 500 mM NaCl et 0,05 % DDM.

Les protéoliposomes ont été préparés à l'aide de lipides totaux d'E. coli (Avanti polar lipids Inc.) comme suit : les lipides solubilisés dans du chloroforme ont d'abord été séchés sous gaz inerte pour former un mince film lipidique dans un tube en verre, puis maintenus sous vide pendant une nuit pour éliminer le chloroforme résiduel. Le film lipidique a ensuite été remis en suspension dans HEPES 20 mM (pH 7,4), NaCl 100 mM puis soniqué sur de la glace jusqu'à ce que la suspension devienne limpide. Après deux cycles de congélation-décongélation, les grandes vésicules multilamellaires générées ont été passées 11 fois à travers un filtre en polycarbonate de 400 nm pour former des liposomes unilamellaires à l'aide d'une mini-extrudeuse (Avanti Polar Lipids Inc). Avant la reconstitution, les liposomes ont d'abord été déstabilisés en ajoutant 5 µl de Triton X-100 à 10 % (poids/volume) pour 1 mg de lipides à température ambiante pendant 30 min. La protéine YfkE a été mélangée avec des liposomes déstabilisés par un détergent dans un rapport de 1:10 (w:w) sur de la glace pendant 20 min. Le détergent a été éliminé en ajoutant des bio-billes au mélange (80 mg de billes pour 1 ml d'échantillon) pour former des protéoliposomes pendant une nuit à 4 ° C avec une agitation douce. Le lendemain, des bio-billes fraîches ont été ajoutées pendant 3 heures supplémentaires pour finaliser la reconstitution.

Pour mesurer l'activité de transport Pi, 200 µl de protéoliposomes reconstitués YfkE 4 mg/ml (pH = 7,4) ont été dilués dans 400 µl de tampon contenant 20 mM HEPES (pH = 8,0), 100 mM NaCl, 5 mM 32P-phosphate (Perkin Elmer) , et 0,5 mM CaCl2 (ou 2 mM EDTA comme contrôle) à température ambiante. Aux temps indiqués, la réaction a été terminée par filtration à travers une membrane de nitrocellulose (0,22 pm) sur un collecteur de filtration Millipore puis lavée immédiatement avec un tampon. Les filtres ont ensuite été séchés à l'air et comptés dans un compteur à scintillation liquide pour déterminer l'activité de transport.

Avant les essais, 10 µg de protéines His-tag YfkE purifiées ont été mélangées avec 100 µl de billes Ni-NTA. 40 mM de 32Pi ont été ajoutés aux billes en présence de 0,5 mM de Ca2+ pendant 10 min. Les billes ont ensuite été lavées abondamment à l'aide d'un tampon protéique sans Pi. Les protéines ont été éluées à l'aide d'imidazole 250 mM et la radioactivité a été mesurée à l'aide d'un compteur à scintillation.

Les changements de conformation des protéines dans l'environnement membranaire natif ont été détectés à l'aide de LRET dans les ISO. Pour garantir un marquage spécifique, deux résidus de cystéine endogène (C34 et C293) ont été remplacés par de la valine en utilisant une mutagenèse dirigée pour générer une construction YfkE sans cystéine. Une paire de résidus cystéine a ensuite été introduite pour le marquage fluorophore : un résidu cystéine C3 a été inséré à l'extrémité N-terminale et un autre résidu cystéine a été placé à la position 56 ou 202 sur la base de la structure YfkE. Une séquence flanquante amino-terminale immédiatement après C3 comprend une étiquette His6 pour augmenter la distance entre le donneur et le récepteur pour des signaux LRET optimaux et un site de clivage de la thrombine pour la normalisation du fond.

ISO a été préparé en utilisant l'approche décrite ci-dessus. Le marquage des vésicules a été effectué en utilisant la chimie réactive au thiol pendant 1 h à température ambiante dans l'obscurité en utilisant 200 nM de dérivé maléimide de fluorophores donneur et accepteur. Les fluorophores utilisés sont le chélate de terbium (Invitrogen) et l'Atto-465 (Sigma). Après marquage, les vésicules ont été dialysées deux fois contre un tampon contenant HEPES 10 mM pH 7,3, KCl 140 mM et saccharose 250 mM pendant 2 h à 4 ° C pour éliminer les sondes en excès. Avant le balayage par fluorescence, du CaCl2 0,5 mM et/ou du phosphate de potassium 5 mM (pH 7,3) ont été mélangés avec des vésicules.

Les mesures de fluorescence ont été effectuées à l'aide d'un spectromètre de durée de vie de fluorescence à base de cuvette QuantaMaster modèle QM3-SS (Photon Technology International). Chaque expérience est rapportée comme une moyenne de trois mesures pour un état donné, chaque mesure ayant une moyenne de 99 impulsions de la lampe flash. Les données ont été collectées à l'aide du logiciel Fluorescan (Photon Technology International) et analysées à l'aide du logiciel Origin (OriginLab Corp). L'émission sensibilisée de l'accepteur a été détectée avant et après le clivage de la thrombine, une technique bien établie utilisée pour soustraire la fluorescence de fond39,40,41. Spécifiquement, après avoir obtenu des mesures de durée de vie de l'accepteur, cinq unités de thrombine bovine (Calbiochem) ont été ajoutées à la cuvette et laissées cliver le fluorophore marqué N-terminal. Le clivage a été achevé 1 à 3 h après l'ajout de thrombine. L'échantillon marqué donneur-accepteur a été excité à 337 nm et l'émission a été détectée à 508 nm. Les distances ont été calculées à l'aide de l'équation de Förster (Eq. (1)):

L'affinité de liaison Ca2+ et Pi a été déterminée à l'aide de la calorimétrie de titrage isotherme (ITC). Les protéines ont été décalcifiées en ajoutant 10 mM d'EGTA puis séparées par chromatographie d'exclusion de taille. La solution Ca2+ ou Pi a été préparée dans le même tampon. Les dosages ITC ont été effectués en titrant Ca2+ dans une solution de protéine YfkE 5 ou 10 μM sur un appareil VP-ITC (Microcal LLC). Tous les tests ont utilisé le même programme ITC : le système a été thermiquement équilibré à 25 °C ; après un délai initial de 120 s, des injections en série (10 μl chacune) ont été effectuées avec un temps d'espacement de 240 s à une vitesse d'agitation de 307 tr/min. Chaque mesure a été corrigée avec un titrage de fond dans lequel le ligand a été titré dans une solution tampon. L'ajustement des données a été réalisé à l'aide du logiciel Origin (Microcal LLC).

Les simulations étaient basées sur la structure cristalline de YfkE orienté vers l'intérieur (PDB 4KJR)12. Toutes les simulations ont été réalisées avec NAMD 2.942 en utilisant le champ de force CHARMM36 pour les protéines et les lipides43,44. Toutes les simulations ont été réalisées à température constante (298 K) et pression semi-isotrope (1 atm), en utilisant des conditions aux limites périodiques et un pas de temps d'intégration de 2 fs. Les interactions électrostatiques à longue portée ont été calculées à l'aide de PME, avec une coupure dans l'espace réel de 12 Å. Les interactions de Van der Waals ont été calculées avec un potentiel de Lennard-Jones, coupé à 12 Å avec une fonction de commutation douce prenant effet à 10 Å. La construction protéique spécifique étudiée est un protomère unique comprenant les résidus 1 à 177 (TM-TM5) et les résidus 200 à 351 (TM6-TM10) ; la boucle cytoplasmique apparemment non structurée reliant TM5 et TM6 était tronquée. La construction protéique a été intégrée dans une bicouche lipidique palmitoyl-oléoyl-phosphatidyl-choline (POPC) hydratée pré-équilibrée à l'aide de GRIFFIN45 et enfermée dans une boîte orthorhombique d'une taille d'environ 88 × 88 × 95 Å. Le système de simulation résultant contient environ 76 700 atomes, dont 207 molécules lipidiques et un tampon KCl 100 mM (Fig. 6 supplémentaire). Le système de simulation a été équilibré selon un protocole étagé comprenant une série de trajectoires MD dans lesquelles les contraintes positionnelles et conformationnelles agissant sur la structure protéique sont progressivement affaiblies sur 100 ns. Pour évaluer l'état de protonation d'une chaîne latérale donnée dans la protéine par rapport à une référence de pKa connu, un acide aminé du même type a été inclus dans le système de simulation libre en solution. Cet acide aminé a été neutralisé à l'extrémité N-terminale avec une modification acétyle et à l'extrémité C-terminale avec un amide secondaire, de manière à isoler l'énergétique de protonation de la chaîne latérale. Tout au long des simulations, l'acide aminé libre a été maintenu en solution et tenu à l'écart de tous les autres solutés (protéine, membrane, ions) grâce à un ensemble de potentiels répulsifs agissant à une certaine distance seuil. Des topologies doubles (protonées et déprotonées) ont été introduites pour la chaîne latérale de la protéine et son équivalent en solution. L'algorithme Free-Energy Perturbation (FEP) a ensuite été utilisé pour modifier les états de protonation des deux chaînes latérales, simultanément mais dans des directions opposées; ainsi, la valeur d'énergie libre résultante reflète l'augmentation ou la diminution de la propension à la protonation de la chaîne latérale de la protéine par rapport à ce qui est intrinsèque pour ce type de chaîne latérale en solution (Fig. 6 supplémentaire). Cette transformation a été effectuée dans les deux sens, c'est-à-dire protonation de la chaîne latérale de la protéine et déprotonation de l'acide aminé libre, et vice versa. Les valeurs ΔΔG indiquées dans le tableau 2 reflètent la valeur moyenne de ces deux calculs ; la demi-différence est fournie sous forme de barre d'erreur. Chaque calcul consistait en une série de simulations MD consécutives dans lesquelles un paramètre l passe de 0 à 1 (ou vice versa) lorsqu'une topologie est progressivement remplacée par l'autre, tandis que les changements correspondants d'énergie potentielle sont annotés pour chaque instantané de simulation. Chaque transformation l a été discrétisée en 40 étapes, dont chacune consistait en une simulation de 1 ns, pour les chaînes latérales à l'intérieur de la protéine, ou 240 ps, ​​pour les chaînes latérales de surface plus mobiles. Ces 40 simulations ont été réalisées séquentiellement ; après chaque changement incrémentiel de l, un fragment de trajectoire (200 ou 40 ps, ​​respectivement) a été considéré comme temps d'équilibrage et omis du calcul de l'énergie libre.

Nous avons analysé les structures de rayons X des protéines qui remplissent les critères suivants : (i) la résolution est de 3,0 Å ou mieux ; (ii) l'identité de séquence avec une structure préalablement sélectionnée est inférieure à 70% ; (iii) les structures ont un ion calcium et un ion phosphate liés, dans un site de liaison commun (c'est-à-dire que la distance minimale entre les deux ions est de 3,2 Å ou moins) ; et (iv) le site de liaison est flanqué de deux chaînes latérales acides et d'une chaîne latérale histidine, comme dans YfkE. Cette étude a abouti à une structure, à savoir celle de la paraoxonase 1 sérique de mammifère (PON1), une hydrolase dépendante du calcium (PDB entrée 3SRE)46.

Le modèle moléculaire de YfkE lié au Ca2+ et au phosphate a été généré avec MODELLER v9.1347. La procédure suivie était similaire à celle utilisée dans la modélisation par homologie, sauf qu'ici la cible était la structure inconnue de l'état lié au Ca2+/phosphate, et la matrice était la structure connue (PDB 4KJR)12. Seule la structure des quatre hélices TM flanquant le site de liaison (les soi-disant répétitions α, c'est-à-dire les résidus 59–110 et 239–296) a été remodelée. Pour modéliser spécifiquement la géométrie du site de liaison, avec Ca2+ et phosphate liés, nous avons ajouté un ensemble de contraintes géométriques déduites des structures susmentionnées de PON1 et NCX_Mj16,30, et des études de transport Ca2+/phosphate des formes sauvages et mutées de YfkE . Plus précisément, ces derniers ont montré que les mutations suivantes provoquent des changements significatifs dans les valeurs mesurées de KM et/ou Vmax, sans abroger le transport : G68A, N69A, N99A, N252A, H256A et Q281A. Ainsi, des contraintes ont été appliquées aux distances suivantes entre Ca2+ et la protéine, en utilisant un potentiel harmonique agissant à des distances égales ou supérieures à 2,6 Å (et une « déviation » de 0,1 Å) : (1) à chacun des quatre atomes d'oxygène parmi les groupes carboxylates de E72 et E255 ; (2) au plus proche des atomes d'oxygène du phosphate (modélisé comme H2PO4−); (3) au carbonyle de G68; et (4) à l'oxygène carbonyle de la chaîne latérale N69. Ensemble, ces quatre contraintes impliquent un nombre de coordination Ca2+ de 7. Des contraintes analogues ont été appliquées aux distances entre l'atome de phosphore et (5) Nδ de H256 à 3,9 Å, (6) Cγ de N252 (4,5 Å) et (7 ) Cy de S278 (4,5 Å) ; et à la distance entre (8) Oε de Q281 et Nδ de N69 (3,2 Å).; et (9) celle entre Cγ de N252 et Cγ de N99 (4,2 Å). Enfin, pour imposer des interactions double-bi-dentées entre Ca2+ et E72 et E255, une contrainte a également été appliquée à (10) les angles dièdres formés par Ca2+ et les atomes Cδ, Oε1 et Oε2 de E72 et E255 (0°, avec ~ écart de 20°). Nous avons généré un ensemble de 2000 modèles au total et analysé cet ensemble par clustering basé sur RMSD par paires ; ce calcul de RMSD comprenait tous les atomes non hydrogène des résidus N69, E72, N99, N252, E255, H256, S278 et Q281, ainsi que les ions Ca2+ et phosphate, et les clusters étaient définis par une valeur seuil de RMSD de 0,6 Å. 15 clusters comprenant plus de 10 modèles ont résulté de cette analyse, ce qui représente 92 % des modèles.

Toutes les expériences ont été réalisées au moins trois fois (n = 3) pour assurer la reproductibilité des données. Tous les points de données et les barres d'erreur (écarts types) sont fournis dans chaque figure et dans les données supplémentaires, le cas échéant.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié (et ses fichiers d'informations supplémentaires). Les données sources pour les chiffres se trouvent dans les données supplémentaires 1.

Les fichiers pour la simulation MD sont disponibles sur https://github.com/Faraldo-Gomez-Lab-at-NIH/Download.

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Nous remercions Mousheng Wu pour la phase initiale de cette étude. Cette étude a été soutenue par les National Institutes of Health (NIH) Grant R01GM143418 et American Heart Association Grant 18TPA34230046 à LZJDF-G. est financé par la Division de la recherche intra-muros du National Heart, Lung and Blood Institute, NIH. Les ressources informatiques ont été en partie fournies par l'installation de calcul scientifique du NIH Biowulf.

Département de biochimie et de biologie moléculaire, Center for Membrane Biology, University of Texas Health Science Center at Houston McGovern Medical School, Houston, TX, États-Unis

Wei Niu, Shuo Lu, Trung Vu, Vasanthi Jayaraman et Lei Zheng

Laboratoire de biophysique moléculaire théorique, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, États-Unis

Wenchang Zhou & José D. Faraldo-Gómez

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Conceptualisation : JDF-G. et LZ; analyse : WN, WZ, SL, TV, VJ, JDF-G. et LZ ; enquête : WN, SL, WZ, TV et VJ ; rédaction—préparation du brouillon original : JDF-G. et LZ; rédaction — révision et édition : tous les auteurs ; tutelle : JDF-G. et LZ; administration du projet : JDF-G. et LZ; financement acquisition : JDF-G. et LZ tous les auteurs ont lu et accepté le manuscrit.

Correspondance à José D. Faraldo-Gómez ou Lei Zheng.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Janesh Kumar et Gene Chong.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Niu, W., Zhou, W., Lu, S. et al. Efflux de Ca2+ facilité par le co-transport de l'anion phosphate inorganique dans l'antiporteur H+/Ca2+ YfkE. Commun Biol 6, 573 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04944-6

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Reçu : 19 mai 2022

Accepté : 15 mai 2023

Publié: 29 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04944-6

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