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May 29, 2023

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Volume Communication Nature

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 3013 (2022) Citer cet article

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L'hypertension pulmonaire est une maladie rare mortelle qui provoque une insuffisance cardiaque droite par élévation de la résistance artérielle pulmonaire. Il existe un besoin médical non satisfait pour le développement de thérapeutiques centrées sur le remodelage vasculaire pulmonaire. Les lipides bioactifs produits par les cellules inflammatoires périvasculaires pourraient moduler le remodelage vasculaire. Ici, nous montrons que les époxydes dérivés d'acides gras ω-3 (époxydes ω-3) libérés par les mastocytes par PAF-AH2, une phospholipase A2 sélective des phospholipides oxydés, régulent négativement l'hypertension pulmonaire. La suppression génétique de Pafah2 chez la souris accélère le remodelage vasculaire, entraînant une exacerbation de l'hypertension pulmonaire hypoxique. Le traitement avec des époxydes ω-3 supprime l'activation des fibroblastes pulmonaires en inhibant la signalisation TGF-β. La supplémentation in vivo en ω-3 époxydes atténue la progression de l'hypertension pulmonaire dans plusieurs modèles animaux. De plus, le séquençage de l'exome entier chez les patients souffrant d'hypertension artérielle pulmonaire identifie deux variantes pathogènes candidates de Pafah2. Nos résultats confirment que l'axe de production d'époxyde PAF-AH2-ω-3 pourrait être une cible thérapeutique prometteuse pour l'hypertension pulmonaire.

L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie rare et mortelle qui provoque une sténose idiopathique de l'artère pulmonaire, ce qui entraîne une augmentation de la pression artérielle pulmonaire et cette surcharge de pression chronique entraîne finalement une insuffisance cardiaque droite et la mort. L'hypertension pulmonaire (HTP) est caractérisée par des modifications tissulaires irréversibles, connues sous le nom de "remodelage vasculaire pulmonaire", impliquant les cellules endothéliales de l'artère pulmonaire, les cellules musculaires lisses et les fibroblastes1,2. Bien que les thérapies disponibles pour l'HTP aient considérablement amélioré la survie des patients atteints d'HTAP3, une partie importante des patients n'atteint pas l'efficacité attendue. Par conséquent, les médicaments qui peuvent supprimer le remodelage vasculaire pulmonaire et réduire la progression de la maladie sont considérés comme un besoin médical non satisfait qui peut potentiellement augmenter la survie des patients4.

Les cellules inflammatoires jouent un rôle important dans le remodelage tissulaire. Dans le remodelage vasculaire pulmonaire, plusieurs types de cellules inflammatoires présentes dans le tissu pulmonaire produisent des facteurs humoraux, tels que des cytokines et des chimiokines, qui contrôlent les altérations du tissu vasculaire1,2,5. De plus, des médiateurs lipidiques sont également produits par les cellules inflammatoires locales et ces médiateurs régulent l'inflammation, la formation de thrombus, l'angiogenèse et la fibrose, qui peuvent tous accélérer le remodelage vasculaire6,7. En fait, il a été démontré que les lipides fonctionnels pro-inflammatoires, tels que les prostanoïdes et les leucotriènes, contribuent à la pathogenèse de PH8,9,10. D'autre part, les acides gras ω-3, principalement l'acide eicosapentaénoïque (EPA) et l'acide docosahexaénoïque (DHA), sont connus pour jouer un rôle bioprotecteur, et certains de leurs dérivés possèdent des fonctions uniques, qui peuvent supprimer le remodelage tissulaire6 ,11,12,13. En utilisant un modèle de remodelage cardiaque induit par une surcharge de pression, notre rapport précédent a démontré que les métabolites de l'EPA libérés par les macrophages supprimaient l'activation anormale des fibroblastes cardiaques et maintenaient l'homéostasie tissulaire14. Par conséquent, les acides gras ω-3 et leurs dérivés devraient également supprimer le remodelage vasculaire pulmonaire dans l'HTP, mais cela reste à déterminer.

Ici, par une analyse lipidomique complète d'échantillons pulmonaires PH et une analyse phénotypique de souris knock-out (KO) du facteur d'activation plaquettaire de type II acétylhydrolase (PAF-AH2), une enzyme productrice d'époxyde ω-3 à partir de phospholipides membranaires, nous avons révélé que les acides gras ω-3 époxydés ont un éther cyclique à 3 chaînons (époxydes ω-3; 17,18-EpETE et 19,20-EpDPE) en tant que médiateurs lipidiques fonctionnels impliqués dans la pathogenèse de l'HTP. Les époxydes oméga-3 étaient constamment produits à partir des mastocytes dans les poumons pour supprimer l'activation anormale des fibroblastes adventices, et ils présentaient des effets thérapeutiques sur le PH même lorsqu'ils étaient administrés à l'extérieur. Nous avons également trouvé des mutations pathogènes de PAF-AH2 chez des patients atteints d'HTAP qui ne répondaient pas suffisamment aux traitements actuels, ce qui suggère que l'époxyde ω-3 pourrait être une cible thérapeutique précieuse pour l'HTAP.

Pour identifier les lipides fonctionnels précieux qui ont été altérés de manière caractéristique dans les poumons PH, nous avons effectué une analyse lipidomique complète à l'aide de la spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide (LC-MS/MS) pour déterminer les métabolites EPA, DHA et acide arachidonique (AA) dans les tissus pulmonaires de souris présentant un PH induit par une hypoxie chronique (concentration en oxygène de 10 %). Nous avons constaté que les niveaux d'époxydes ω-3, 17,18-EpETE et 19,20-EpDPE, et leurs dihydrodiols inactifs, 17,18-diHETE et 19,20-diHDoPE, étaient réduits dans les tissus des poumons hypoxiques (Fig. 1a–c, Fig. 1a–e supplémentaire). Correspondant à ces résultats, l'expression de PAF-AH2, une enzyme clé qui appartient à la famille des phospholipases A2 et qui hydrolyse préférentiellement les phospholipides membranaires contenant des ω-3 époxydes pour libérer des ω-3 époxydes15, a également été significativement réduite dans les tissus des poumons hypoxiques ( figure 2a).

a, b Métabolites d'acides gras oméga-3 dans la lipidomique basée sur LC-MS/MS des poumons de souris WT exposées à la normoxie ou à l'hypoxie (10 % O2) pendant 4, 14 et 28 jours. a Métabolites EPA, b Métabolites DHA. Le score Z a été calculé à partir de la valeur moyenne de chaque groupe (n = 3) et présenté sous forme de carte thermique. c La teneur en ω-3 époxydes (17,18-EpETE et 19,20-EpDPE) et leurs dihydrodiols (17,18-diHETE et 19,20-diHDoPE) évalués par LC-MS/MS basé sur la lipidomique des poumons de Souris WT soumises à la normoxie ou à l'hypoxie pendant 4, 14 et 28 jours (n = 3). Les données sont moyennes ± SEM. Les valeurs P ont été déterminées par ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Dunnett.

un Western blot de PAF-AH2 en protéines totales provenant des poumons de souris WT et de souris Pafah2 KO exposées à la normoxie ou à l'hypoxie pendant 8 semaines (à gauche) et quantification par densitométrie (à droite). Les expériences ont été répétées trois fois et les données ont été regroupées. b La teneur en ω-3 époxydes évaluée par LC-MS/MS-lipidomique des poumons chez des souris WT et des souris Pafah2 KO exposées à l'hypoxie pendant 8 semaines (n = 4,5). c Image représentative de coupes histologiques avec coloration HE (en haut) et coloration EVG (en bas) des poumons chez des souris WT, Pafah2 KO et Pla2g7 KO exposées à la normoxie ou à l'hypoxie pendant 8 semaines. Barre d'échelle, 50 μm. d–f L'évaluation de la sévérité de l'HTP chez les souris WT, Pafah2 KO et Pla2g7 KO exposées à la normoxie ou à l'hypoxie pendant 8 semaines (normoxie, n = 4,4,4 ; hypoxie, n = 6,8,6). Épaisseur de paroi des artérioles pulmonaires (d), RVSP (e), rapport pondéral de RV à LV + septum (f). Les expériences ont été répétées deux fois et les données ont été regroupées (e, f). g Niveaux relatifs d'ARNm de Nppa dans le RV de souris WT exposées à l'hypoxie et de souris Pafah2 KO (n = 6, 8). Les niveaux d'expression ont été normalisés à ceux de l'ARN ribosomique 18S, puis à ceux du RV des souris WT. h Courbes de Kaplan – Meier de souris WT, Pafah2 KO et Pla2g7 KO exposées à l'hypoxie jusqu'à 100 jours (n = 16). Test du log-rank ; WT contre Pafah2 KO, P = 0,002, Pafah2 KO contre Pla2g7 KO, P = 0,011. Les expériences ont été répétées trois fois et les données ont été regroupées. i Niveaux relatifs d'ARNm de Col1a1 dans les poumons de souris WT et de souris Pafah2 KO exposées à la normoxie ou à l'hypoxie pendant 8 semaines (n = 6). Les niveaux d'expression ont été normalisés à ceux de l'ARN ribosomique 18S, puis à ceux des poumons de souris WT. j Image représentative de l'immunohistochimie de la vimentine et du CD31 dans les poumons de souris WT et de souris Pafah2 KO exposées à l'hypoxie pendant 8 semaines. Les noyaux ont été marqués au DAPI. Barre d'échelle, 50 μm. Les données sont moyennes ± SEM. Les valeurs P ont été déterminées par ANOVA bidirectionnelle avec le test post hoc de Bonferroni ( a ), ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Tukey ( d - f ) ou le test T de Student bilatéral ( b , g , i ).

Afin de déterminer l'importance des ω-3 époxydes dans le développement de l'HTP, nous avons étudié le phénotype de souris déficientes en PAF-AH2 soumises à une hypoxie chronique (8 semaines). Les souris Pafah2 KO ont produit des quantités inférieures d'époxydes ω-3, en particulier 17,18-EpETE et 19, 20-EpDPE, dans leurs poumons dans des conditions hypoxiques, par rapport aux souris de type sauvage (WT) (Fig. 2b, Fig. 2a supplémentaire ). L'analyse histologique a révélé que les souris Pafah2 KO atteintes d'HTP présentaient un remodelage vasculaire pulmonaire avancé, tel qu'un épaississement de la paroi de l'artère pulmonaire et une fibrose périvasculaire sévère (Fig. 2c, d). Conformément à ces résultats, les souris Pafah2 KO avaient une pression systolique ventriculaire droite (RVSP) plus élevée lors de l'examen par cathéter cardiaque que les souris WT, indiquant ainsi une sévérité accrue de l'HTP (Fig. 2e). De plus, les souris Pafah2 KO avec PH hypoxique présentaient une insuffisance cardiaque droite avancée, telle qu'une augmentation de l'hypertrophie ventriculaire droite (RV) (Fig. 2f) et des niveaux d'ARNm plus élevés de Nppa, un marqueur d'insuffisance cardiaque, dans le RV (Fig. 2g), résultant dans un taux de mortalité élevé de près de 80% en 100 jours après l'exposition hypoxique (Fig. 2h). Bien que nous ayons évalué les impacts du sexe sur le modèle de souris PH, aucune différence n'a été observée dans la gravité du PH hypoxique et dans le phénotype du PH exacerbé chez les souris Pafah2 KO (Fig. 3a – d supplémentaires). Le remodelage vasculaire pulmonaire induit par l'hypoxie des souris Pafah2 KO était caractérisé par une fibrose périvasculaire sévère, comme l'indiquent les niveaux plus élevés d'ARNm Col1a1 ainsi que les zones positives pour la vimentine dans les vaisseaux pulmonaires (Fig. 2i, j). De plus, nous avons évalué le phénotype de PH en utilisant des souris PAF-AH KO de type plasma (Pla2g7 KO), une enzyme qui a une activité enzymatique PAF-acétyl hydrolase similaire à celle de PAF-AH216,17, mais aucune altération grave du PH n'a été observée. observé (Fig. 2c–f, h). Ces résultats suggèrent que les métabolites lipidiques propres au PAF-AH2, par exemple les époxydes ω-3, jouent un rôle majeur dans la progression de l'HTP.

Ensuite, nous avons identifié le type de cellules responsables de la production d'époxydes ω-3 dans les poumons. L'immunohistochimie fluorescente d'échantillons pulmonaires du modèle de souris hypoxique PH, du modèle de souris Sugen/hypoxie PH et de patients humains idiopathiques atteints d'HTAP a révélé que les cellules exprimant PAF-AH2 étaient des mastocytes tryptase-positifs, mais pas des macrophages, des fibroblastes, des cellules endothéliales et des voies respiratoires. cellules épithéliales (Fig. 3a, Fig. Supplémentaire 4a, b). Conformément aux conclusions des rapports précédents18,19, les mastocytes se sont accumulés autour des vaisseaux pulmonaires dans les poumons PH (Fig. 3b).

a Image représentative de l'immunomarquage de PAF-AH2, Tryptase et CD31 dans les poumons de souris PH ou de patients PAH. SuHx ; Sugen/hypoxie. Barre d'échelle, 50 μm. b Image représentative de la coloration au bleu de toluidine de coupes pulmonaires chez des souris PH, des rats PH ou des patients PAH. Les flèches indiquent les mastocytes positifs au bleu de toluidine. Lumière vasculaire V, MCT Monocrotaline. Barre d'échelle, 50 μm. c Schéma de principe des souris Kit W-sh/W-sh reconstituées avec des BMMC soumises à PH. Cathétérisme cardiaque droit RHC. d Image représentative de la coloration EVG des artérioles pulmonaires chez les souris Kit W-sh/W-sh reconstituées avec des BMMC WT (WT → W-sh) ou des BMMC Pafah2 KO (Pafah2 KO → W-sh) après 4 semaines d'exposition hypoxique. Barre d'échelle, 50 μm. e–g L'évaluation de la sévérité de l'HTP des souris Kit W-sh/W-sh reconstituées par BMMC exposées à l'hypoxie (n = 5,7). Épaisseur de paroi des artérioles pulmonaires (e), RVSP (f), rapport pondéral de RV à LV + septum (g). Les expériences ont été répétées deux fois et les données ont été regroupées (f, g). Niveaux relatifs d'ARNm de Nppa dans RV (h) et Col1a1 dans les poumons (i) de souris Kit W-sh/W-sh reconstituées par BMMC exposées à l'hypoxie. (n = 4,5). Les niveaux d'expression ont été normalisés à ceux de l'ARN ribosomique 18S, puis à ceux du RV ou du poumon des souris WT → W-sh. Les données sont moyennes ± SEM. Les valeurs P ont été déterminées par le test T de Student bilatéral.

Pour déterminer si les mastocytes exprimant PAF-AH2 ont contribué au phénotype PH sévère observé chez les souris Pafah2 KO, nous avons préparé des souris déficientes en mastocytes (Kit W-sh/W-sh) et les avons reconstituées avec des mastocytes dérivés de la moelle osseuse (BMMCs ) de souris WT ou de souris Pafah2 KO. Nous avons ensuite exposé ces souris à l'hypoxie pendant 4 semaines (Fig. 3c). Quatre semaines après l'injection de BMMC, un nombre suffisant de mastocytes positifs à la tryptase et positifs au PAF-AH2 a pu être confirmé dans les poumons des souris reconstituées (Fig. 4c, d supplémentaires). Comme prévu, les souris Kit W-sh / W-sh reconstituées avec des BMMC Pafah2 KO présentaient un phénotype PH sévère par rapport à celles reconstituées avec des BMMC WT (Fig. 3d – i), suggérant que le manque d'activité PAF-AH2 dans le mât cellules était responsable du phénotype des souris Pafah2 KO dans des conditions hypoxiques.

Les époxydes oméga-3 sont connus pour favoriser la dégranulation dépendante des IgE dans les mastocytes15. Nous avons étudié si la dégranulation induite par l'hypoxie des mastocytes était affectée par la présence ou l'absence de PAF-AH2 in vivo. Alors que l'hypoxie augmentait les mastocytes dans les poumons et augmentait légèrement leur dégranulation, le nombre total et le taux de dégranulation des mastocytes dans les poumons n'ont montré aucune différence significative entre les souris WT et les souris Pafah2 KO sous normoxie ou hypoxie (Fig. 5a, b). De plus, la dégranulation dépendante de l'hypoxie des BMMC évaluée par la libération de β-HEX in vitro était presque comparable entre les BMMC WT et les BMMC Pafah2 KO (Fig. 5c supplémentaire).

Afin d'étudier si la dégranulation des mastocytes médiait l'exacerbation du PH hypoxique en l'absence de PAF-AH2 in vivo, nous avons évalué l'amélioration du PH hypoxique chez des souris Pafah2 KO lorsqu'elles étaient administrées avec du kétotifène, un stabilisateur de mastocytes qui inhibe sa dégranulation. . Bien que le kétotifène ait significativement supprimé la dégranulation dépendante de l'hypoxie des mastocytes dans les poumons (Fig. 5d supplémentaire), les souris Pafah2 KO présentaient un PH sévère quel que soit le traitement au kétotifène (Fig. 5e – g supplémentaire), indiquant que la dégranulation des mastocytes était n'est pas impliqué dans le mécanisme sous-jacent à l'HTP sévère induite par l'absence de PAF-AH2.

Étant donné que les mastocytes sécrètent des époxydes ω-3 même au repos, indépendamment de la stimulation de l'antigène IgE15, nous avons émis l'hypothèse que les époxydes ω-3 des mastocytes agissaient et contrôlaient les cellules constitutives de l'artère pulmonaire de manière paracrine, en particulier les fibroblastes périvasculaires. qui ont été activés de manière significative chez les souris Pafah2 KO exposées à l'hypoxie (Fig. 2i, j). Pour examiner l'impact des lipides libérés par les mastocytes sur les fibroblastes pulmonaires, nous avons ajouté des extraits lipidiques de la fraction d'acides gras libres isolée des surnageants de culture des BMMC aux fibroblastes pulmonaires murins cultivés primaires. Les extraits lipidiques des BMMC Pafah2 KO ont augmenté la prolifération des fibroblastes et les expressions d'ARNm des marqueurs d'activation des fibroblastes, y compris Col1a1 et Acta2, par rapport aux surnageants des BMMC WT. Un traitement additif avec des époxydes ω-3 a supprimé la prolifération aberrante et la régulation à la hausse des gènes marqueurs d'activation dans les fibroblastes stimulés avec des extraits lipidiques des BMMC Pafah2 KO (Fig. 4a, Fig. 6a supplémentaire). La prolifération des fibroblastes pulmonaires a été supprimée par un traitement avec des époxydes ω-3, du 17,18-EpETE ou du 19,20-EpDPE, mais pas par l'EPA, le DHA ou leurs dihydrodiols (Fig. 4b, Fig. 6b supplémentaire). En nous concentrant sur la signalisation du TGF-β, qui est étroitement liée à la fibrose tissulaire et à la physiopathologie du PAH1,20, nous avons évalué l'efficacité des époxydes ω-3 sur les fibroblastes pulmonaires. Le traitement des époxydes ω-3 a supprimé de manière significative l'expression de l'ARNm de Col1a1, Acta2 et Il6 (Fig. 4c) et l'expression de SM22α, un marqueur de myofibroblastes, dans les fibroblastes pulmonaires dans des conditions stimulées par le TGF-β (Fig. 4d) , indiquant ainsi que les époxydes ω-3 supprimaient l'activation des fibroblastes. De plus, les époxydes ω-3 présentaient également un effet inhibiteur sur la migration des fibroblastes pulmonaires (Fig. 6c supplémentaire). L'autre acide gras époxydé, un époxyde ω-6 comprenant du 14,15-EET, n'a pas présenté d'effets inhibiteurs sur les fibroblastes pulmonaires activés par le TGF-β (Fig. 7a, b supplémentaires). Il a été confirmé que les époxydes ω-3 inhibaient la phosphorylation de Smad2, un substrat en amont de la voie de signalisation du TGF-β, suggérant que cette voie était l'un des mécanismes d'action (Fig. 4e).

a Nombre relatif de fibroblastes pulmonaires stimulés par des extraits lipidiques de milieu de culture de BMMC lorsqu'ils sont traités avec ou sans ω-3 époxydes (1 μM) pendant 48 h (n = 4). Les données sont représentatives de 2 répétitions expérimentales indépendantes. b Nombre relatif de fibroblastes pulmonaires traités avec le véhicule, 17,18-EpETE (1 μM), 17,18-diHETE (1 μM), 19,20-EpDPE (1 μM), 19,20-diHDoPE (1 μM), EPA (1 μM), ou DHA (1 μM) pendant 48 h (n = 4). Les données sont représentatives de 3 répétitions expérimentales indépendantes. c Niveaux d'expression relatifs des ARNm Col1a1, Acta2 et Il6 dans les fibroblastes pulmonaires traités avec le véhicule, 17,18-EpETE (1 μM) ou 19,20-EpDPE (1 μM) pendant 6 h lorsqu'ils sont stimulés avec ou sans TGF-β (2,5 ng/ml) (n = 4). Les niveaux d'expression ont été normalisés à ceux de l'ARN ribosomique 18S, puis à ceux des fibroblastes témoins non stimulés. Les données sont représentatives de 3 répétitions expérimentales indépendantes. d Immunomarquage de SM22α dans les fibroblastes pulmonaires traités avec le véhicule, 17,18-EpETE (1 μM), 19,20-EpDPE (1 μM), EPA (1 μM) ou DHA (1 μM) pendant 24 h lorsqu'il est stimulé avec ou sans TGF-β (2,5 ng/ml) (à gauche). Barre d'échelle, 50 μm. Rapport des cellules SM22α-positives aux fibroblastes pulmonaires totaux (à droite) (n = 4). Les données sont représentatives de 2 répétitions expérimentales indépendantes. e Western blot de pSmad2, Smad2 et β-Actine dans des extraits protéiques totaux de fibroblastes pulmonaires lors de l'administration de véhicule, 17,18-EpETE (1 μM) ou 19,20-EpDPE (1 μM) avec ou sans stimulation par le TGF-β (1 ng/ml et 2,5 ng/ml) pendant 15 min (à gauche) et quantification par densitométrie (à droite). Les expériences ont été répétées trois fois et les données ont été regroupées. Les données sont moyennes ± SEM. Les valeurs P ont été déterminées par ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Dunnett (a–d) ou ANOVA bidirectionnelle avec le test post hoc de Tukey (e).

Des études antérieures ont démontré que des anomalies dans les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses de l'artère pulmonaire sont significativement impliquées dans la pathogenèse de l'HTAP1,2. Cependant, les époxydes ω-3 n'ont pas affecté l'expression génique associée à la physiopathologie de l'HAP dans les cellules endothéliales de l'artère pulmonaire (Fig. 8a supplémentaire) et n'ont pas exercé d'effets antioxydants sur les cellules endothéliales pour les protéger contre les lésions oxydatives (Fig. 8b, c supplémentaires). ). De plus, la prolifération des cellules musculaires lisses de l'artère pulmonaire n'a pas été affectée par le traitement avec les extraits lipidiques des BMMC (Fig. 8d supplémentaire) ou avec les époxydes ω-3 (Fig. 8e supplémentaire).

Nous avons également évalué un mécanisme régulant l'expression de PAF-AH2 dans les mastocytes. Comme on le voit dans les poumons hypoxiques in vivo (Fig. 2a), l'expression de Pafah2 était également régulée à la baisse dans les BMMC lorsqu'elles étaient cultivées sous hypoxie in vitro (Fig. 9a supplémentaire), alors que l'expression de Cyp4a12, une enzyme responsable de l'époxydation ω-321, dans les BMMC est resté inchangé (Fig. 9a supplémentaire). Lorsqu'il est administré avec de la diméthyloxalyglycine (DMOG) ou du CoCl2, activateurs du facteur inductible par l'hypoxie (HIF), l'expression de Pafah2 a été réduite dans les BMMC (Fig. 9b supplémentaire), ce qui suggère que PAF-AH2 était régulé par HIF.

Nous avons validé le potentiel thérapeutique des ω-3 époxydes pour les HAP. Dans les modèles murins d'hypoxie chronique PH, le 19,20-EpDPE a été administré deux semaines après l'exposition hypoxique à une dose de 0,05 mg/kg/jour par injection intrapéritonéale tous les jours. Les administrations de 19,20-EpDPE ont significativement amélioré le PH en supprimant le remodelage vasculaire pulmonaire avancé, y compris la fibrose périvasculaire, à la fois chez les souris WT et chez les souris Pafah2 KO, mais le DHA ou l'époxyde ω-6, le 14,15-EET, n'a pas présenté les effets bénéfiques. (Fig. 5a–d, Fig. 10a–d supplémentaire).

une image représentative de la coloration EVG (en haut) et de l'immunomarquage de la vimentine et du CD31 (en bas) dans les poumons de souris WT exposées à l'hypoxie et de souris Pafah2 KO lorsqu'elles sont administrées avec du PBS, du DHA (0,05 mg/kg/jour) ou du 19,20-EpDPE (0,05 mg/kg/jour) ip tous les jours. Ces administrations ont commencé 2 semaines après l'exposition hypoxique. Barre d'échelle, 50 μm. b–d L'évaluation de la sévérité de l'HTP chez les souris WT exposées à l'hypoxie et les souris Pafah2 KO lorsqu'elles sont administrées avec du PBS, du DHA ou du 19,20-EpDPE (souris WT, n = 6,6,7 ; souris Pafah2 KO, n = 7, 6,7). Épaisseur de paroi des artérioles pulmonaires (b), RVSP (c), rapport pondéral de RV à LV + septum (d). Les expériences ont été répétées deux fois et les données ont été regroupées (c, d). e Image représentative de la coloration EVG (en haut) et de l'immunomarquage de la vimentine et du CD31 (en bas) dans les poumons de souris WT traitées par Sugen/hypoxie lors de l'administration de véhicule, de DHA (0,05 mg/kg/jour) ou de 19,20-EpDPE (0,05 mg /kg/jour) ip tous les jours. Ces administrations ont commencé 3 semaines après l'exposition hypoxique. Barre d'échelle, 50 μm. f – h L'évaluation de la sévérité de l'HTP chez les souris WT traitées par Sugen/hypoxie lorsqu'elles sont administrées avec du PBS, du DHA ou du 19,20-EpDPE (n = 6,5,6). Épaisseur de paroi des artérioles pulmonaires (f), RVSP (g), rapport pondéral de RV à LV + septum (h). Les données sont moyennes ± SEM. Les valeurs P ont été déterminées par ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Dunnett.

De plus, nous avons évalué l'efficacité des époxydes ω-3 dans un modèle de souris Sugen/hypoxia PH, qui a montré un phénotype PH plus sévère. L'administration de 19,20-EpDPE, mais pas de DHA, a atténué la gravité de l'HTP chez les souris Sugen / hypoxie (Fig. 5e – h), comme observé dans le modèle d'HTP hypoxique chronique. Ces résultats indiquent qu'une supplémentation in vivo avec des époxydes ω-3 peut être un traitement viable pour l'HTP.

Afin de déterminer si des anomalies de PAF-AH2 étaient impliquées dans le développement de l'HTAP humaine, nous avons recherché des variants pathogènes dans Pafah2 chez les patients atteints d'HTP en utilisant le séquençage de l'exome entier. Nous avons analysé des échantillons de sang de 262 patients, dont 90 HTAP idiopathiques, 61 HTAP héréditaires et 54 HTAP associées à une maladie du tissu conjonctif (tableau supplémentaire 1). Nous avons trouvé deux variantes importantes de Pafah2, p.Arg85Cys (R85C)/c.253C>T et p.Gln184Arg (Q184R)/c.551A>G, qui étaient présumées hautement pathogènes chez trois patients atteints d'HTAP (tableau supplémentaire 2) . Ces SNP avaient des scores élevés d'épuisement dépendant de l'annotation combinée (CADD) qui indiquaient une pathogénicité élevée. De plus, ces variants ont été trouvés sur un site différent des sites catalytiques de Pafah2 (Fig. 6a). En utilisant le modèle d'homologie des protéines PAF-AH2 comme modèle initial, il a été démontré que les variantes simulées de PAF-AH2 p.R85C et PAF-AH2 p.Q184R présentaient des changements de conformation par rapport à la protéine native (Fig. 6b). De plus, nous avons examiné les impacts des variants Pafah2 en exprimant les protéines mutantes à l'aide de vecteurs pcDNA in vitro. Les niveaux des protéines mutantes, PAF-AH2 p.R85C et p.Q184R, étaient significativement réduits par rapport à ceux du PAF-AH2 natif, mais le niveau de PAF-AH2 S236C, une variante au site catalytique, était inchangé ( figure 6c). Fait intéressant, le traitement avec MG132, un inhibiteur du protéasome, a partiellement récupéré les niveaux de protéines de PAF-AH2 p.R85C et p.Q184R (Fig. 6c), suggérant que la dégradation des protéines était due au système protéasome ubiquitine. Pris ensemble, les variants Pafah2 p.R85C et p.Q184R trouvés chez les patients atteints d'HTAP ont été considérés comme contribuant à la progression de l'HTP en augmentant la vulnérabilité de la protéine PAF-AH2 à la dégradation.

a Diagramme schématique des emplacements de 2 candidats à la mutation pathogène dans le gène Pafah2 humain. b Le modèle structurel de PAF-AH2 variante p.R85C (jaune à gauche), variante p.Q184R (jaune à droite) et forme native (bleu), montrant les instantanés empilés de 300 images obtenues à partir de l'image 2700–3000 (correspondant à 54 à 60 nanosecondes). Les flèches montrent la conformation modifiée dans chaque modèle de variante par rapport au modèle de forme natif. c Western blot de PAF-AH2 dans des cellules HEK 293 exprimant des variants humains de Pafah2 à l'aide de vecteurs pcDNA lorsqu'ils sont traités avec ou sans MG132 (10 μM) pendant 6 h (en haut) et quantification par densitométrie (en bas). Les expériences ont été répétées quatre fois et les données ont été regroupées. d Résumé graphique. Les données sont moyennes ± SEM. Les valeurs P ont été déterminées par ANOVA à deux voies avec le test post hoc de Tukey.

Dans cette étude, nous avons démontré que les époxydes ω-3 neutralisent le développement de l'HTP en régulant le remodelage vasculaire des artères pulmonaires. Ceci est basé sur nos découvertes selon lesquelles (a) les époxydes ω-3 dans le tissu pulmonaire ont diminué avec la progression de l'HTP, (b) l'HTP a été exacerbée chez les souris dépourvues de PAF-AH2, une enzyme productrice d'époxyde ω-3, et ( c) la supplémentation en ω-3 époxydes a atténué la sévérité de l'HTP dans plusieurs modèles de maladie.

Les acides gras époxydés avec un éther cyclique à 3 chaînons sont des lipides hautement réactifs; par exemple, les acides gras époxydés dérivés de l'acide arachidonique (époxyeicosanoïdes ; EET) ont plusieurs fonctions qui affectent divers processus, tels que l'angiogenèse et l'anti-inflammation, qui contribuent au maintien de l'homéostasie22,23,24. D'autre part, les acides gras ω-3 sont connus pour avoir des effets bioprotecteurs, y compris la cardioprotection25,26,27, et ces dernières années, il a été révélé que leurs composés époxy exercent de puissants effets physiologiques uniques tels que des effets anti-inflammatoires, vasodilatateurs et tumoraux. -effets suppressifs28,29,30,31,32,33,34. De manière intéressante, l'action anti-fibrotique et l'amélioration du PH exercées par les époxydes ω-3 observées dans cette étude n'ont pas pu être confirmées lorsque les acides gras ω-3 (EPA et DHA) ont été administrés à la même dose, suggérant que ces fonctions étaient spécifiques à ω-3 époxydes. Bien que leurs points d'action n'aient pas été définitivement identifiés en détail jusqu'à présent, la voie de signalisation du TGF-β peut être impliquée dans le mécanisme sous-jacent car le 19, 20-EpDPE, un époxyde ω-3, a supprimé de manière significative la phosphorylation de Smad2, qui est stimulé par le TGF-β, dans les fibroblastes pulmonaires.

La sélectivité de substrat du PAF-AH de type plasma et du PAF-AH2 est similaire16. En plus du PAF, les deux PAF-AH peuvent hydrolyser les phospholipides avec une chaîne acyle gras sn-2 courte et/ou oxydée, mais hydrolysent à peine les phospholipides avec deux longues chaînes acyle gras. Récemment, il est devenu clair que les deux PAF-AH peuvent hydrolyser les phospholipides oxydés non fragmentés, tels que les phospholipides contenant du F2-isoprostane, à une vitesse lente. De plus, le PAF-AH de type plasma peut également hydrolyser les hydroperoxydes de phospholipides. D'autre part, il a été récemment montré que le PAF-AH2 a l'activité unique qui libère des époxydes ω-3 à partir des phospholipides15. Nous avons évalué la sévérité de l'HTP hypoxique chez les souris Pla2g7 KO, mais aucune différence significative par rapport aux souris WT n'a été observée. Ainsi, nous avons déterminé que le phénotype aggravé de l'HTP hypoxique était spécifique aux souris Pafah2 KO et que les époxydes ω-3 produits par PAF-AH2 étaient étroitement liés à la sévérité de l'HTP. Le rôle du PAF-AH de type plasmatique dans l'HTP hypoxique n'a jamais été rapporté et reste relativement inconnu. Dans cette étude, le taux de survie des souris Pla2g7 KO avec un PH hypoxique n'est pas significatif mais pire que chez les souris témoins avec un PH hypoxique (Fig. 2h), ce qui suggère que le PAF-AH de type plasma pourrait contribuer à la vulnérabilité contre le PH hypoxique ou l'hypoxie. lui-même.

La spécificité du type cellulaire diffère également entre les deux enzymes. Le PAF-AH de type plasma, qui est sécrété par les monocytes, les macrophages et les lymphocytes T, est principalement exprimé dans la zone riche en macrophages des plaques d'athérosclérose35. En revanche, PAF-AH2 est exprimé dans les hépatocytes, les cellules épithéliales tubulaires rénales et fortement exprimé dans les mastocytes36. Les mastocytes contiennent une quantité considérable de PAF-AH2, suggérant que cette enzyme est essentielle pour les fonctions des mastocytes. Shimanaka et al. ont démontré que les époxydes ω-3 produits par le PAF-AH2 favorisent la dégranulation des mastocytes, qui joue un rôle majeur dans l'inflammation allergique15. D'autre part, notre étude a montré que les époxydes ω-3 des mastocytes jouaient un rôle bioprotecteur dans les poumons lorsqu'ils étaient exposés à l'hypoxie. De plus, Shimanaka et al. ont rapporté que les époxydes ω-3 agissaient à l'intérieur des mastocytes15 ; tandis que dans notre étude, ils ont été libérés de la cellule pour agir sur d'autres cellules environnantes. En effet, puisque des ω-3 époxydes ont été détectés dans le surnageant de culture des BMMC, on peut considérer que les mastocytes libèrent des ω-3 époxydes vers l'espace extracellulaire. Fait intéressant, les mastocytes sont connus pour dégranuler légèrement même lorsqu'ils sont exposés à l'hypoxie37, mais aucune différence significative n'a été observée dans les BMMC WT et les BMMC Pafah2 KO, indiquant ainsi que les époxydes ω-3 n'affectaient pas la dégranulation induite par l'hypoxie et indépendante des IgE. .

Les mastocytes sont largement présents dans les poumons car ils sont les principales cellules inflammatoires pulmonaires et sont étroitement associés à des réactions allergiques telles que l'asthme38. Il a été rapporté que les mastocytes sont impliqués dans la pathogenèse de l'HTP, et on pense que la dégranulation des mastocytes favorise l'inflammation et exacerbe l'HTP18,19,39,40. Cependant, on sait que les mastocytes possèdent également des propriétés anti-inflammatoires41,42. Par conséquent, dans les études utilisant des souris déficientes en mastocytes, il reste à déterminer si les mastocytes sont bénéfiques ou néfastes pour l'HTP. Dans notre étude, l'administration de Ketotifen, un suppresseur de la dégranulation des mastocytes, n'a pas affecté la sévérité du PH hypoxique chez la souris. Par conséquent, dans les conditions de cette étude, les mastocytes n'ont pas exacerbé l'état pathologique par dégranulation mais ont plutôt supprimé la progression de l'HTP en libérant des époxydes ω-3.

Plusieurs modèles animaux de PH ont été développés ces dernières années, et les limites de chaque modèle doivent être comprises. Le modèle d'HTP mené par l'hypoxie seule peut être mieux classé dans l'HTP du groupe III (HTP due à des maladies pulmonaires et/ou à l'hypoxie) que dans l'HAP du groupe I (HTAP). Dans cette étude, afin de clarifier la relation entre une molécule spécifique et la physiopathologie de l'HTP à l'aide de souris génétiquement modifiées, nous avons d'abord utilisé un modèle à un seul coup avec uniquement une stimulation hypoxique. Les résultats expérimentaux du modèle PH hypoxique pourraient expliquer en partie le mécanisme commun sous-jacent au PH. Cependant, le modèle animal dans lequel la gravité et les modifications tissulaires étaient similaires à celles du groupe I PH devait également être utilisé. Pour démontrer l'importance et l'efficacité de l'axe époxyde PAF-AH2-ω-3 dans l'HAP, nous avons mené des expériences dans lesquelles des époxydes ω-3 ont été administrés aux souris Sugen/hypoxia PH dans la présente étude.

On pense que le remodelage vasculaire dans l'HTP est principalement causé par des anomalies des cellules endothéliales vasculaires et des cellules musculaires lisses. Cependant, les souris Pafah2 KO avec PH hypoxique présentaient une fibrose périvasculaire marquée, suggérant que la fibrose affectait fortement l'exacerbation de l'HTP. Fait intéressant, les époxydes ω-3 n'ont pas modifié de manière significative l'expression des gènes et la prolifération cellulaire des cellules endothéliales de l'artère pulmonaire et des cellules musculaires lisses in vitro. De plus, les mastocytes libérant des époxydes ω-3 dans leur environnement étaient localisés dans l'espace interstitiel autour des vaisseaux sanguins, ce qui suggérait que les fibroblastes périvasculaires étaient la cible des époxydes ω-3.

Dans cette étude, nous avons identifié des mutations faux-sens étroitement associées à la pathogénicité de l'HTP à l'aide d'un programme prédictif (score CADD> 30 ; SIFT, délétère ; Polyphen ; probablement dommageable) à partir des données de séquençage de l'exome entier chez les patients atteints d'HTAP. La plupart des patients porteurs de ces mutations répondaient mal aux agents thérapeutiques existants, principalement les vasodilatateurs. De plus, des expériences utilisant le vecteur d'expression dans des cellules cultivées ont révélé un niveau réduit de protéine exprimée associé aux deux mutations. L'expression forcée de PAF-AH2 dans BMMC a été tentée avec le vecteur plasmidique mais sans succès. Par conséquent, les cellules HEK293, qui sont des cellules d'origine humaine qui produisent une quantité suffisante de protéine cible via la transfection du vecteur plasmidique et qui ont une faible production endogène de protéine PAF-AH2, ont été sélectionnées comme cellules transfectées. Puisque le traitement avec un inhibiteur du protéasome restaure les niveaux des protéines mutantes, nous pensons que des modifications post-traductionnelles telles que l'ubiquitination sont impliquées dans la réduction due aux mutations. À l'avenir, une souris knock-in de PAF-AH2 humain hébergeant ces mutations devrait être générée pour déterminer si l'HTP se développerait naturellement ou présenterait une exacerbation.

Le principal traitement de l'HTP comprend la vasodilatation fonctionnelle par divers agents thérapeutiques, notamment la prostaglandine I2, l'oxyde nitrique et l'inhibition de la phosphodiestérase-5 ; cependant, il n'y a pas de médicaments fondamentaux modificateurs de la maladie qui peuvent inhiber la progression de l'HTP. Le remodelage de l'artère pulmonaire, qui implique des cellules inflammatoires telles que les mastocytes, est considéré comme un mécanisme sous-jacent clé de l'HTP. Dans cette étude, nous avons révélé que les époxydes ω-3 produits par les mastocytes pulmonaires étaient des candidats pour un médicament thérapeutique efficace qui supprime le remodelage vasculaire pulmonaire. À l'avenir, nous espérons développer une méthode thérapeutique précieuse utilisant des époxydes ω-3 dans le but de supprimer le remodelage vasculaire pulmonaire chez les patients atteints d'HTAP présentant des mutations PAF-AH2 qui ne peuvent pas être traités efficacement avec des dilatateurs de l'artère pulmonaire.

Toutes les procédures de la présente étude étaient conformes aux principes énoncés dans le guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire publié par les National Institutes of Health (NIH) des États-Unis et ont été approuvées par le Laboratory Animal Center, Keio University School of Medicine (No. D2012 -021 et n° 15063).

Des souris Pafah2 KO ont été rétrocroisées avec des souris C57BL/6 pendant plus de 10 générations36. Des souris Pla2g7 KO (arrière-plan C57BL/6J) ont été aimablement reçues du Dr Stafforini (Université de l'Utah). Les souris mâles ont été utilisées pour toutes les expériences, à l'exception de celles de la Fig. 3 supplémentaire. Dans toutes les expériences utilisant des souris KO (7 à 10 semaines), des souris C57BL / 6J appariées selon l'âge et le sexe ont été utilisées comme témoins. Des souris mutantes Kit déficientes en mastocytes (C57BL/6J-Kit W-sh/W-sh) ont été achetées auprès des Jackson Laboratories. Toutes les souris ont été hébergées dans des installations exemptes d'agents pathogènes spécifiques à température contrôlée (23 ° C) avec un cycle lumière-obscurité de 12 h, avec un accès gratuit à la nourriture de laboratoire standard (CE2; CLEA Japan Inc.) et à l'eau à l'Université de Keio.

L'EPA, le DHA, l'AA, le 17,18-EpETE, le 19,20-EpDPE, le 17,18-diHETE, le 19,20-diHDoPE, le 14,15-EET et d'autres métabolites d'acides gras ont été obtenus auprès de Cayman Chemical.

Des tissus pulmonaires droits murins ont été récoltés et immédiatement placés dans de l'azote liquide. Après cryobroyage des échantillons, les lipides ont été extraits par la méthode de Bligh et Dyer43. Les solutions extraites ont été séchées avec un évaporateur centrifuge, dissoutes dans du méthanol: isopropanol = 1: 1 et stockées à -20 ° C. Les métabolites d'acides gras ont été purifiés davantage à partir des tissus par extraction en phase solide à l'aide de colonnes InertSep NH2 (GL Science) avec un étalon interne marqué au deutérium (11(12)-EET-d11). En bref, les colonnes InertSep NH2 ont été préconditionnées avec 6 ml d'hexane et les lipides extraits des tissus par la méthode de Bligh et Dyer ont été appliqués avec 500 μL de chloroforme. Les colonnes ont ensuite été lavées avec 6 ml de chloroforme/isopropanol (2/1, v/v), puis éluées avec de l'éther diéthylique/acide acétique (98/2, v/v). Les solutions extraites ont été séchées avec un évaporateur centrifuge, dissoutes dans du méthanol : isopropanol = 1:1 et stockées à -20 °C44.

Pour la détection des métabolites d'acides gras, des analyses lipidomiques basées sur LC/ESI-MS ont été réalisées sur un système Shimadzu Nexera UPLC (Shimadzu) couplé à un spectromètre de masse à piège à ions linéaire triple quadripôle hybride QTRAP 4500 (AB SCIEX). La séparation chromatographique a été effectuée sur une colonne ACQUITY UPLC HSS T3 (2,1 × 100 mm, 1,8 µm ; Waters) maintenue à 40 °C en utilisant la phase mobile A (eau/acide acétique (100/0,1, v/v) contenant 10 mM d'acétate d'ammonium ) et phase mobile B (acétonitrile/méthanol (4/1, v/v) contenant 10 mM d'acétate d'ammonium) dans un programme gradient (0–2 min : 90 % A ; 2–10 min : 90 % A → 30 % A ; 10–24 min : 30 % A → 27 % A ; 24–27 min : 1 % A ; 27–32 min : 90 % A) avec un débit de 0,2 ml/min (0–10 min), 0,1 ml /min (10–15 min), 0,2 ml/min (15–24 min) et 0,5 ml/min (24–32 min). Les paramètres de l'instrument étaient les suivants : gaz rideau, 10 psi ; tension de pulvérisation ionique, -4500 V; température, 600 °C; gaz source d'ions 1, 70 psi; gaz source d'ions 2, 80 psi. La détection spécifique a été réalisée par MRM comme décrit précédemment15,44.

Dans le modèle de souris à hypoxie chronique, les souris ont été hébergées dans une chambre hypoxique (10 % d'O2) maintenue à l'aide d'un générateur d'air hypoxique (TEIJIN) et surveillée avec un analyseur d'O2 (JIKO-255), pendant 4 ou 8 semaines. Le modèle de souris Sugen/hypoxie a été généré selon un rapport précédent45. En bref, 20 mg/kg d'inhibiteur du VEGF, Sugen (SU5416 ; S8442, Sigma-Aldrich), mis en suspension dans du CMC (0,5 % [p/v] carboxyméthylcellulose sodique, 0,9 % [p/v] chlorure de sodium, 0,4 % [v/v] polysorbate 80, 0,9 % [v/v] alcool benzylique dans de l'eau déionisée), a été injecté par voie sous-cutanée à des souris (C57BL/6J) aux jours 0, 7 et 14. Les souris ont été logées dans une chambre hypoxique ( 10% O2) pendant 7 semaines. Les animaux ont été nourris avec un régime standard. Les études ont été réalisées conformément aux directives des National Institutes of Health pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

Chaque souris a été anesthésiée à l'aide d'isoflurane à 1,5 % sur une plaque chauffante et surveillée pour la fréquence cardiaque et par électrocardiogramme. Un cathéter à micropointe (Millar) a été inséré dans le RV via la veine jugulaire droite pour mesurer le RVSP. Les mesures hémodynamiques ont été analysées à l'aide du Lab Chart 8 (instruments AD). Le cœur a été retiré pour l'évaluation de l'hypertrophie RV [rapport pondéral du RV et (ventricule gauche + septum)] et de l'extraction d'ARN, et les poumons ont été préparés pour l'analyse morphométrique et l'extraction d'ARN.

Les cellules BM obtenues à partir de souris ont été cultivées dans un milieu complet BMMC contenant de l'IL-3 comprenant du DMEM, 10 % de FBS, 2 mM de L-glutamine, 100 UI/ml de pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine, 100 mM d'acides aminés non essentiels et 5 ng /ml de rIL-3 de souris pour préparer les BMMC46. Après 4 à 6 semaines de culture, plus de 95 % des cellules flottantes ont été confirmées comme étant des mastocytes Kit+ FcεRI+ par cytométrie en flux. La dégranulation des BMMC a été évaluée par les quantités de β-HEX libérées dans un dosage enzymatique utilisant du 4-nitrophényl N-acétyl-β-glucosaminide.

Pour obtenir un milieu conditionné à partir de BMMC, 1 × 107 BMMC ont été cultivés dans un milieu complet BMMC contenant de l'IL-3 pendant 2 jours. Les lipides neutres, les phospholipides et les acides gras libres ont été extraits du milieu conditionné par extraction en phase solide à l'aide de cartouches Sep-Pak C18 (Waters). En bref, le milieu conditionné a été ajouté à des colonnes Sep-Pak et les lipides neuronaux ont été élues avec 10 ml d'hexane. Les acides gras libres ont ensuite été élues avec 10 ml de formiate de méthyle. Les phospholipides ont finalement été élues avec 10 ml de méthanol. La fraction d'acides gras libres a été utilisée comme expériences.

Les BMMC (5 × 106 cellules) ont été reconstituées par injection intraveineuse à des souris mâles Kit W-sh/Wsh âgées de 6 semaines. Quatre semaines après la reconstitution, les souris ont été soumises à une hypoxie pour induire le PH. La distribution et la maturation des BMMC reconstituées dans les poumons ont été évaluées par coloration au bleu de toluidine ou immunomarquage fluorescent.

Le sel de fumarate de kétotifène (Sigma) a été dissous dans H2O et administré par voie orale à des souris pendant 4 semaines dans des conditions hypoxiques. Les consommations d'eau potable chez les souris du groupe recevant du kétotifène n'étaient pas différentes de celles du groupe témoin.

Les mastocytes positifs au bleu de toluidine ont été comptés dans toute la section pulmonaire, qui ont été mesurées au moins 20 sections dans chaque souris au microscope optique. Les mastocytes périvasculaires ont été classés en granulés et dégranulés sur la base de l'extrusion de granules sécrétoires18. Les mastocytes granulés ont un cytoplasme dense, tandis que les mastocytes dégranulés ont un cytoplasme léger avec des taches vides en raison de la décharge de granules sécrétoires. Un indice de granulation a été calculé comme le rapport nombre de mastocytes granulés/nombre de mastocytes dégranulés.

Les poumons de souris ont été prélevés, gonflés par la trachée avec du paraformaldéhyde à 4 % à une pression de 25 cmH2O, puis fixés dans du paraformaldéhyde à 4 %. Les échantillons ont été inclus dans de la paraffine et sectionnés à une épaisseur de 4 μm, et ont été colorés avec de l'hématoxiline-éosine (HE), Elastica-van Gieson (EVG) et une coloration au bleu de toluidine. Au moins 10 vaisseaux périphériques (<100 μm de diamètre) présentant un profil approximativement circulatoire ont été choisis au hasard dans chaque section pulmonaire et analysés en pourcentage d'épaisseur de paroi à l'aide de la formule suivante : [(diamètre vasculaire - lumière vasculaire)/diamètre vasculaire] × 100. Tous des analyses morphométriques ont été réalisées simultanément et en aveugle aux conditions d'étude.

Pour l'immunohistochimie des coupes de paraffine pulmonaire, la récupération des coupes de paraffine a été effectuée à l'aide d'une solution de récupération (solution de récupération cible S1700, Dako) dans un bain d'eau bouillante pendant 20 min. Les coupes ont été refroidies à température ambiante pendant 30 min. Après lavage, les coupes ont été incubées avec l'anticorps primaire (anti-CD31 [E-AB-70021; Elabscience; 1:200] pour les échantillons murins ou anti-CD31 [ab182981; Abcam; 1:2000] pour les échantillons humains) à 4 °C pendant la nuit. L'anticorps primaire a été visualisé à l'aide d'IgG de chèvre anti-lapin conjugué à Alexa488 (Invitrogen; 1: 2000). Pour la contre-coloration à la Vimentine, l'immunocoloration a été réalisée à l'aide du kit d'immunodétection de fluorescéine anti-Vimentine (ab8978 ; Abcam ; 1:200) et MOM avec le kit de blocage Avidin/Biotin (Vector Laboratories) et Streptavidin Texas Red (Vector Laboratories), conformément aux instructions du fabricant. protocole. Pour le contre-coloré avec Tryptase et PAF-AH2, l'immunocoloration a été réalisée en utilisant l'anti-Tryptase (NPB2-26444; Novus; 1: 100) et le kit d'immunodétection de fluorescéine MOM avec le kit de blocage d'avidine / biotine et la streptavidine AMCA (Vector Laboratories). L'anticorps monoclonal anti-PAF-AH2 TI1036 (1:100) a été marqué par le kit de marquage HiLyte Fluor 555 (Dojindo Molecular Technologies). Les sections ont été montées avec fluoromount-G avec DAPI (Invitrogen) ou Fluoromount (Diagnostic BioSystems). Les images ont été acquises avec un microscope à fluorescence (BZ-9000; Keyence).

Pour les "Figures supplémentaires", l'immunomarquage de coupes de paraffine pulmonaire murine a été réalisée à l'aide des anticorps primaires (anti-podoplanine ; AF3244 ; R&D Systems ; 1:40, anti-Mac3 ; 550292 ; BD Biosciences ; 1:100 et anti-Vimentin ; ab92547 ; Abcam ; 1:200) et visualisé à l'aide d'IgG anti-chèvre d'âne conjugué à Alexa 546, d'IgG anti-rat de chèvre conjugué à Alexa546 ou d'IgG anti-lapin de chèvre conjugué à Alexa 594 (Invitrogen ; 1:2000), respectivement. Pour la contre-coloration avec PAF-AH2, l'immunocoloration a été réalisée à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-PAF-AH2 TI10 (1: 100) et d'un kit d'immunodétection de fluorescéine MOM avec kit de blocage avidine / biotine et avidine fluorescéine DCS (Vector Laboratories). Dans l'immunomarquage de coupes de paraffine pulmonaire humaine, les anticorps primaires (anti-Podoplanin ; AF3670 ; R&D Systems ; 1:100, anti-CD68 ; #76437 ; Cell Signaling Technology ; 1:200 et anti-Vimentin ; ab92547 ; Abcam ; 1 :200) ont été utilisés et visualisés par des IgG anti-mouton d'âne conjugués à Alexa594 ou des IgG anti-lapin de chèvre conjugués à Alexa594 (Invitrogen ; 1:2000), respectivement. Pour la contre-coloration avec PAF-AH2, un anticorps anti-PAF-AH2 TI10 (1: 100) et une IgG anti-souris de chèvre conjuguée à Alexa 488 ont été utilisés (1: 2000).

Les fibroblastes pulmonaires primaires ensemencés dans une boîte à base de verre de 35 mm (Iwaki) ont été fixés avec du paraformaldéhyde à 4 % et perméabilisés avec du Triton X-100 à 0,2 % pendant 10 min, puis bloqués avec du sérum à 1 % pendant une heure. Les cellules ont été colorées avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4°C. L'IgG de chèvre anti-lapin/souris conjuguée à Alexa488 (Invitrogen; 1:2000) a été incubée pendant une heure à température ambiante co-colorée avec du DAPI. Les principaux anticorps utilisés dans la présente étude étaient anti-SM22α (ab14106 ; Abcam ; 1:100) et anti-PCNA (ab29 ; Abcam ; 1:100). Les images ont été acquises avec un microscope à fluorescence (BZ-9000; Keyence).

Les poumons ont été perfusés et digérés avec de la collagénase II (Worthington Biochemical Crop). Les cellules dissociées ont été incubées pendant une heure. Les cellules restantes ont été remises en suspension dans du DMEM (Wako) contenant 10 % de sérum bovin fœtal et placées sur des boîtes de culture Primaria (BD). Après 24h, le milieu de culture est changé. Après 3 jours et 5 jours supplémentaires, les cultures de fibroblastes ont été repiquées et utilisées dans les expériences.

Des fibroblastes pulmonaires et des cellules musculaires lisses ont été ensemencés sur des plaques à 96 puits. Après 12 h, des époxydes ω-3 ou des extraits lipidiques ont été ajoutés aux plaques, et des proliférations cellulaires ont été observées pendant 48 h à l'aide du test de viabilité cellulaire RealTime-Glo MT (Promega) pendant 48 h sur un lecteur de microplaques (Gen5 Synergy HTX ; BioTek Instruments ).

La migration cellulaire a été réalisée à l'aide d'un test de chambre de Boyden avec des chambres d'invasion à membrane à 24 puits et à pores de 8 μm (ThermoFisher). 2 × 104 cellules ont été ensemencées dans la chambre supérieure du transwell. Des époxydes oméga-3 ou des acides gras ω-3 ont été ajoutés dans la chambre inférieure. Après 24 h, les membranes avec les cellules migrées ont été fixées avec du méthanol et colorées avec du bleu de toluidine. Les images ont été acquises avec un microscope (BZ-9000; Keyence) et le nombre de cellules migrantes a été quantifié par des champs aléatoires 10 ×.

Des cellules endothéliales pulmonaires humaines (Gibco) ont été cultivées sous 5 % de CO2 à 37 °C en utilisant le milieu EGM-2 BulletKit (CC-3162 ; Lonza). Des cellules musculaires lisses artérielles pulmonaires humaines (Kurabo) ont également été cultivées en utilisant du DMEM (Wako) contenant 20 % de milieu de sérum bovin fœtal. Les cellules ont été utilisées entre les passages 4 à 8.

Les mesures des niveaux intercellulaires d'espèces réactives de l'oxygène ont été effectuées à l'aide du kit de dosage cellulaire ROS (abcam). Des cellules endothéliales d'artère pulmonaire humaine ont été ensemencées sur des plaques à 96 puits. Après 12 h, des époxydes ω-3 ou des acides gras ω-3 ont été ajoutés aux plaques avec ou sans stimulation par H2O2 (500 μM ou 1 mM). Une heure plus tard, du diacétate de 2′,7′-dichlorofluorescine a été ajouté aux plaques et la 2′,7′-dichlorofluorescine a été dosée par spectroscopie de fluorescence avec excitation/émission à 485 nm/535 nm sur un lecteur de microplaques (Gen5 Synergy HTX ; BioTek Instruments).

Les cellules endothéliales de l'artère pulmonaire ont été ensemencées sur des plaques à 96 puits. Après 12 h, des époxydes ω-3 ou des acides gras ω-3 ont été ajoutés aux plaques avec ou sans stimulation par H2O2 (500 μM ou 1 mM). Deux heures plus tard, le nombre de cellules viables a été mesuré à l'aide du test de viabilité cellulaire luminescent CellTiter-Glo (Promega) sur un lecteur de microplaques (Gen5 Synergy HTX; BioTek Instruments).

Nous avons utilisé les vecteurs plasmidiques pcDNA3.1(+) (V790202, Invitrogen) portant un ADNc Pafah2 humain complet (séquence de référence NCBI : NM_000437.4) cloné à partir de la bibliothèque d'ADNc de cerveau humain (Life Technologies, Inc.)47. En utilisant le kit de mutagenèse dirigée Quik Change (Agilent) conformément au manuel d'instructions, nous avons introduit une substitution de base unique dans le plasmide portant l'ADNc Pafah2 natif pour générer les variantes R85C (253C> T), Q184R (551A> G) et S236C (707C>G) et a confirmé la présence de mutations par séquençage d'ADN. Des plasmides pcDNA Pafah2 natifs ou mutants (3, 5 μg par boîte à 6 puits) ont été transfectés dans des cellules HEK293 à l'aide de Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Après 48 h, le milieu de culture a été changé et exposé au DMEM avec ou sans MG132 (10 μM) pendant 6 h. Par la suite, les cellules ont été recueillies et la quantité de protéine PAF-AH2 exprimée a été analysée par Western blot. Des cellules HEK293 transfectées par des vecteurs pcDNA vides ont été utilisées comme témoins.

Des quantités égales de la protéine totale isolée à partir de poumons murins, de fibroblastes de culture primaire ou de cellules HEK293 ont été préparées dans un tampon de dosage par radioimmunoprécipitation contenant 50 mM de Tris – HCl (pH 7,6), 150 mM de NaCl, 1 % de Nonidet-P40, 0,5 % de désoxycholate de sodium, et 0,1 % de dodécylsulfate de sodium (SDS), et additionné de dithiothréitol (DTT) 1 mM, de MG132 100 nM, d'un cocktail d'inhibiteurs de protéase et d'un cocktail d'inhibiteurs de phosphatase (Nacalai Tesque). Pour l'analyse par Western blot, des quantités égales de protéines totales (10 à 15 μg) du lysat ont été soumises à une électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide. Les principaux anticorps utilisés dans la présente étude étaient anti-PAF-AH2 (TI10 ; 1:1000), anti-β-Actin (sc-47778 ; Santa Cruz Biotechnology ; 1:1000), anti-p-Smad 2 S465/467 (#3108) et anti-Smad 2 (#5339) (Cell Signaling Technology ; 1:1000). Les bandes de protéines ont été visualisées à l'aide d'anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (1: 2000) et d'une chimiluminescence améliorée (Chemi-Lumi One Super; Nacalai Tesque) sur un LAS-4000 mini (GE Healthcare). Les bandes de protéines ont été quantifiées à l'aide d'ImageJ ver1.52.

Pour la PCR quantitative en temps réel, des échantillons d'ARN total provenant de poumons, de RV ou de fibroblastes pulmonaires ont été préparés à l'aide du réactif Trizol (Invitrogen). Des échantillons d'ARN total (0,2 à 0,5 μg) ont été transcrits à l'aide du kit de transcription inverse d'ADNc haute capacité (Applied Biosystems). L'expression quantitative de l'ARNm a été évaluée par PCR en temps réel à l'aide du THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (Toyobo). Les échantillons ont été analysés sur le ViiA7 (Applied Biosystems) et les données ont été analysées par la méthode delta-delta CT. L'ARN ribosomique 18S a été amplifié et utilisé comme contrôle interne. Les séquences d'amorces pour les gènes sont répertoriées dans le tableau supplémentaire S3.

Cette étude a été approuvée par l'Institutional Review Board (IRB) de l'hôpital universitaire de Keio (IRB No : 20140203), et tous les tests génétiques ont été effectués avec le consentement éclairé des patients après un conseil génétique. Nous avons inclus et analysé des échantillons de sang de 262 patients, dont 90 HTAP idiopathiques, 61 HTAP héréditaires et 54 HTAP associées à des maladies du tissu conjonctif (âge moyen : 45,5 ± 16,6 ans ; femmes, 78,0 % ; pression artérielle pulmonaire moyenne, 42,9 ± 15,5 mmHg) . Nous avons effectué le séquençage de l'exome entier à l'aide d'une plate-forme HiSeq 2500 (Illumina, San Diego, CA) et du kit SureSelectXT Human All Exon (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) pour la capture de l'hybridation. La pathogénicité des variants a été évaluée avec CADD, SIFT et PolyPhen-248,49. En ce qui concerne les variantes du gène Pafah2 dans les données de séquençage de l'exome entier des patients atteints d'HTP, nous avons sélectionné des mutations faux-sens avec un score CADD égal ou supérieur à 30 (MIS30). Les gènes connus liés à l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) comprennent le gène du récepteur de la protéine morphogénétique osseuse de type 2 (BMPR2), le gène de type 1 du récepteur de l'activine A (ACVRL1), le gène de l'endogline (ENG), le gène de la cavéoline-1 (CAV-1), le T gène -box 4 (TBX4), gène membre 3 de la sous-famille K du canal potassique (KCNK3), facteur de traduction d'initiation eucaryote 2 a kinase 4 (EIF2AK4), SMAD, adénosine triphosphate 13A3 (ATP13A3), gène aquaporine 1 (AQP1), facteur de différenciation de croissance 2 (GDF2) et le gène 17 du membre 17 de la famille des boîtes du groupe à mobilité élevée lié à SRY (SOX17), qui ont été sélectionnés selon le rapport précédent48.

Le modèle structurel 3D initial de PAF-AH2 a été obtenu à l'aide d'une modélisation par homologie à l'aide du SWISS-MODEL50. La structure cristalline du PAF-AH de type plasma (numéro PDB : 5i9i.1.A) a été utilisée comme matrice (identité de séquence 42,33 %, score GMQE 0,74)51. La simulation de la dynamique moléculaire a été réalisée dans des conditions solubles dans l'eau à l'aide de la version 2.1252 de Nanoscale Molecular Dynamics (NAMD) avec Chemistry at Harvard Molecular Mechanics (CHARMM) 36 force field53. La position et le vecteur de vitesse de chaque atome et molécule d'eau ont été calculés toutes les 2,0 femtosecondes (1 × 10−15 s) et la sommation Particle Mesh Ewald (PME) avec une longueur de coupure de 12 Å pour les interactions directes a été utilisée pour prédire l'interaction électrostatique à longue portée54. La simulation a été faite avec les options de rigibBonds all et le système a été neutralisé avec du NaCl en condition physiologique (150 mEq/l). Les molécules d'eau ont été modélisées comme des molécules d'eau à potentiel intermoléculaire transférables (TIP3P). La structure initiale de chaque mutant a été obtenue en induisant la substitution d'acides aminés contre la structure initiale de type sauvage dans un état soluble dans l'eau à l'aide du plugin de résidu muté de Visual Molecular Dynamics (VMD) version 1.9.352. La structure stable de chaque mutant avec le type sauvage a été calculée en exécutant la simulation pendant 72 nanosecondes. L'écart quadratique moyen (RMSD) a été utilisé pour confirmer que le calcul s'est stabilisé (Fig. Supplémentaire 11a – c). La RMSD a été calculée avec des distances relatives au modèle initial. Alors que le modèle initial du type sauvage était le résultat immédiat de la modélisation d'homologie solvatée dans l'eau, les modèles initiaux pour les mutants étaient la structure stable du type sauvage (après une simulation de 60 nanosecondes). Tous les résultats ont été visualisés à l'aide de VMD version 1.9.3. La simulation a été réalisée avec une taille limite de 7,37 nm × 8,34 nm × 8,22 nm avec une condition limite périodique. Les nombres d'atomes étaient respectivement de 46628, 46615 et 46635 pour les modèles WT, R85C et Q184R (y compris les eaux et les ions). Les instantanés empilés de 300 images obtenues à partir de l'image 2700–3000 (correspondant à 54–60 nanosecondes), une fenêtre temporelle représentant les fluctuations structurelles après la stabilisation du modèle, ont été présentés sous forme de figures.

Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Le score Z des données lipidomiques a été calculé à l'aide de Microsoft Excel 2019 et présenté sous forme de carte thermique. La signification statistique des différences entre les 2 groupes a été déterminée à l'aide du test T de Student non apparié. Les différences entre plusieurs groupes ont été comparées à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle ou bidirectionnelle suivie de tests post hoc. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism version 9. Une valeur de P < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles dans l'article et ses informations supplémentaires. Les données lipidomiques ont été déposées dans Metabolomics Workbench sous le numéro d'accession ST001951 (https://doi.org/10.21228/M8PH6J). La structure cristalline du PAF-AH de type plasma utilisée dans cette étude est disponible dans la Protein Data Bank sous le numéro PDB : 5I9I (https://www.rcsb.org/structure/5I9I). Les données de séquençage de l'exome entier ne sont pas accessibles au public en raison de la présence d'informations susceptibles de compromettre la confidentialité des participants à la recherche. Afin d'obtenir les données pseudonymisées au niveau individuel, les chercheurs doivent contacter le membre principal du comité d'accès aux données (MK) à [email protected] et faire des demandes scientifiquement appropriées. Dans l'ensemble, ces données ne peuvent être utilisées qu'à des fins de recherche et ne sont pas disponibles à des fins commerciales. Toutes les candidatures doivent détailler le but scientifique, les objectifs, les méthodes, le calendrier, la gestion des données, les considérations éthiques, les questions financières et les intérêts concurrents, et inclure également un plan de projet et des informations sur l'entité responsable de la recherche ainsi que sur le chercheur principal. Toutes les demandes seront examinées par l'IRB de l'Université de Keio et exigeront que le chercheur demandeur signe un accord d'accès aux données avec l'Université de Keio. Les demandes de données seront traitées dans un délai d'un mois si une approbation éthique écrite est soumise à l'auteur. Les données sources sont fournies avec cet article.

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Nous tenons à remercier Yoshiko Miyake (Université Keio) et Seiichi Kotoda (Bio research center company, Japon) pour leur excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par l'Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED) sous les numéros de subvention JP22gm5910014 (JE) et JP22gm1210013 (NK), SENSHIN Medical Research Foundation (JE), Japan Research Foundation for Clinical Pharmacology (JE) et Keio University Grant -in-Aid for Encouragement of Young Medical Scientists (HM).

Département de cardiologie, École de médecine de l'Université Keio, Tokyo, Japon

Hidenori Moriyama, Jin Endo, Masaharu Kataoka, Shinichi Goto, Hiroki Kitakata, Takahiro Hiraide, Naohiro Yoshida, Sarasa Isobe, Tsunehisa Yamamoto, Kohsuke Shirakawa, Atsushi Anzai, Yoshinori Katsumata, Keiichi Fukuda et Motoaki Sano

Laboratoire de chimie de la santé, École supérieure des sciences pharmaceutiques, Université de Tokyo, Tokyo, Japon

Yuta Shimanaka, Nozomu Kono et Hiroyuki Arai

Département de biochimie, École de médecine de l'Université Keio, Tokyo, Japon

Yuki Sugiura et Makoto Suematsu

Centre de génétique médicale, École de médecine de l'Université Keio, Tokyo, Japon

Kenjiro Kosaki

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HM et JE ont conçu et réalisé les expériences, analysé les données et rédigé le manuscrit. MK et TH ont recueilli les échantillons des patients et analysé les données. Y.Shimanaka, Y.Sugiura et NK ont effectué une analyse lipidomique complète. SG a effectué une simulation de dynamique moléculaire. HK, NY, SI, TY, KS, AA et YK ont réalisé les expériences et analysé les données. KK a effectué un séquençage complet de l'exsome. M.Suematsu, KF, HA et M.Sano ont conçu les expériences et interprété les résultats.

Correspondance à Jin Endo.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Mark Nicolls, Wen Tian, ​​Karsten Weylandt et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Moriyama, H., Endo, J., Kataoka, M. et al. Les époxydes d'acides gras oméga-3 produits par PAF-AH2 dans les mastocytes régulent le remodelage vasculaire pulmonaire. Nat Commun 13, 3013 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30621-z

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Reçu : 03 mars 2021

Accepté : 03 mai 2022

Publié: 31 mai 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-30621-z

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