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Sep 08, 2023

Biosynthèse de novo du cholestérol chez les bactéries

Volume Communication Nature

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 2904 (2023) Citer cet article

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Les eucaryotes produisent des stérols hautement modifiés, dont le cholestérol, essentiels à la physiologie eucaryote. Bien que peu d'espèces bactériennes soient connues pour produire des stérols, la production de novo de cholestérol ou d'autres stérols complexes dans les bactéries n'a pas été rapportée. Ici, nous montrons que la myxobactérie marine Enhygromyxa salina produit du cholestérol et fournissons des preuves pour d'autres modifications en aval. Grâce à une analyse bioinformatique, nous identifions une voie putative de biosynthèse du cholestérol chez E. salina largement homologue à la voie eucaryote. Cependant, des preuves expérimentales indiquent que la déméthylation complète en C-4 se produit par le biais de protéines bactériennes uniques, distinguant la biosynthèse bactérienne et eucaryote du cholestérol. De plus, les protéines de la cyanobactérie Calothrix sp. NIES-4105 sont également capables de déméthyler complètement les stérols en position C-4, ce qui suggère que la biosynthèse complexe des stérols peut être trouvée dans d'autres phylums bactériens. Nos résultats révèlent une complexité méconnue dans la production de stérols bactériens qui rivalise avec les eucaryotes et mettent en évidence la relation évolutive compliquée entre la biosynthèse des stérols dans les domaines bactérien et eucaryote.

Les stérols sont une classe de lipides eucaryotes omniprésents et essentiels importants dans une variété de fonctions physiologiques, y compris la signalisation cellulaire, l'homéostasie membranaire et le rythme de développement1,2,3. La biosynthèse des stérols eucaryotes a été étudiée de manière approfondie, révélant des voies de biosynthèse complexes, y compris un ensemble partagé d'enzymes utilisées pour produire des produits finaux de stérols similaires dont le niveau d'insaturations, de déméthylations et d'alkalytions varie4,5. L'ordre des réactions dans ces voies de biosynthèse dicte la production et l'accumulation d'intermédiaires de stérols qui jouent un rôle régulateur dans l'homéostasie des lipides6,7, la biosynthèse des produits en aval8 et la réponse au stress9. Les modifications chimiques requises pour synthétiser le cholestérol chez les vertébrés, les phytostérols chez les plantes et l'ergostérol chez les champignons sont essentielles aux propriétés biophysiques de ces lipides, affectant la localisation et la dynamique membranaire dans leurs organismes respectifs10,11,12. Ces stérols servent également de point de ramification pour la biosynthèse des métabolites en aval. Les réactions d'oxydation sont impliquées dans la conversion des stérols en une large gamme de composés, notamment les oxystérols, les acides biliaires, les hormones stéroïdes et les brassinostéroïdes, qui peuvent tous fonctionner comme des ligands dans diverses voies de signalisation13,14,15. Les eucaryotes conjuguent également les stérols aux sucres, aux protéines et à d'autres lipides, élargissant encore la fonction des stérols pour inclure la défense cellulaire, le stockage d'énergie, la digestion et la signalisation16,17,18. Dans l'ensemble, la complexité de la biosynthèse des stérols eucaryotes reflète les diverses fonctions et les rôles importants que jouent ces lipides dans la physiologie eucaryote.

Alors que la biosynthèse et la fonction des stérols ont été bien étudiées chez les organismes eucaryotes, la synthèse et la fonction des stérols bactériens sont relativement sous-explorées. Plusieurs bactéries, y compris les méthanotrophes aérobies, les planctomycètes et diverses myxobactéries sont connues pour produire des stérols de novo19. Contrairement aux eucaryotes, ces bactéries produisent en grande partie du lanostérol, du parkéol ou du cycloarténol, les premiers produits de cyclisation de l'oxydosqualène cyclase (OSC)20,21,22. Cependant, certaines bactéries effectuent des modifications chimiques supplémentaires lors de la synthèse des stérols ; les bactéries méthanotrophes modifient les stérols en structures monométhylées distinctes spécifiques aux Methylococcaceae19, les Planctomycètes producteurs de stérols conjuguent les stérols à une macromolécule non identifiée21, et plusieurs Myxococcota23 produisent des intermédiaires dans la voie de biosynthèse du cholestérol, dont le zymostérol19,22,24. De plus, des études phylogénomiques ont augmenté le nombre de producteurs potentiels de stérols bactériens, identifiant les gènes nécessaires à la fois à la cyclisation et aux modifications en aval des phylums à travers le domaine bactérien25,26. Plusieurs de ces bactéries ont le potentiel génétique de produire les stérols biosynthétiquement complexes associés aux eucaryotes, y compris le cholestérol, mais les analyses lipidiques doivent encore confirmer la présence de ces stérols dans les bactéries5.

L'écart entre la capacité génomique de production de stérols complexes et les stérols observés dans les bactéries nous a incités à entreprendre des analyses lipidiques plus complètes des bactéries productrices de stérols. Des études phylogénétiques antérieures et notre propre analyse initiale des gènes de biosynthèse des stérols de la myxobactérie marine Enhygromyxa salina ont suggéré le potentiel de production de stérols plus biosynthétiquement complexes que ceux observés précédemment. Nous avons émis l'hypothèse que les analyses précédentes auraient pu sous-estimer l'inventaire des stérols bactériens en raison d'une biomasse limitée et/ou de techniques d'extraction de lipides inadéquates, ce qui nous a motivés à réanalyser les stérols de cette bactérie. De même, l'analyse des cyanobactéries Calothrix sp. Le génome NIES-4105 a identifié un groupe de gènes putatifs de la biosynthèse des stérols, y compris ceux nécessaires à la biosynthèse complexe des stérols, ce qui nous a conduit à étendre notre analyse des stérols à cette bactérie.

Dans ce travail, nous revisitons l'analyse des stérols chez E. salina, révélant une capacité à synthétiser le cholestérol. Notre analyse bioinformatique a identifié des homologues de certaines étapes de la biosynthèse du cholestérol eucaryote, mais pas de toutes, différenciant la production bactérienne de cholestérol de celle des eucaryotes. En outre, nous démontrons que la déméthylation complète en C-4, une étape essentielle de la biosynthèse des stérols eucaryotes, se produit par le biais de protéines bactériennes distinctes dans E. salina et que les homologues trouvés dans la bactérie productrice de stérols phylogénétiquement distincte, Calothrix, fonctionnent de manière similaire. Dans l'ensemble, nos analyses de la biosynthèse des stérols dans ces bactéries phylogénétiquement distinctes suggèrent une biologie complexe sous-tendant la production bactérienne de cholestérol et soulèvent des questions plus larges sur la biosynthèse, l'évolution et la fonction des stérols.

Nous avons précédemment démontré la production de zymostérol, un intermédiaire biosynthétique dans la synthèse du cholestérol, dans des extraits lipidiques de la myxobactérie Enhygromyxa salina19. Cependant, E. salina est une bactérie prédatrice sociale souvent cultivée sur de la gélose solide contenant de la levure à cellules entières, ce qui limite la quantité de biomasse disponible pour des analyses lipidiques approfondies27. Ces conditions de culture présentent également une source potentielle de contamination par les stérols, car la gélose et la levure supplémentaire peuvent contenir des stérols. Pour mieux évaluer l'inventaire de stérols de cet organisme, nous avons cultivé E. salina dans un milieu liquide additionné de cellules entières d'Escherichia coli, qui ne produit pas de stérols de manière native. Ces conditions de culture ont multiplié par 50 les lipides extractibles, permettant des analyses plus approfondies.

Nous avons d'abord extrait les lipides libres de la biomasse d'E. salina par une extraction Bligh-Dyer28. Ces analyses initiales ont révélé une variété de stérols, y compris le cholestérol (Fig. 1a; Fig. 1 supplémentaire, Fig. 2 supplémentaire). Nous avons également détecté du 4,4-diméthylcholesta-8,24-diénol, un intermédiaire uniquement déméthylé en C-14, indiquant que E. salina effectue une déméthylation en C-14 avant la déméthylation en C-4, comme les champignons et les animaux, et non après l'élimination du premier groupe méthyle C-4, comme les plantes5. Nous avons également détecté plusieurs intermédiaires en aval non saturés en C-24, notamment le zymostérol, le cholesta-7,24-diénol et le desmostérol, mais aucun intermédiaire saturé en C-24. L'accumulation de seuls intermédiaires insaturés en C-24 suggère qu'E. salina favorise la voie de biosynthèse du cholestérol de Bloch, où la réduction du C-24 se produit comme étape finale de la biosynthèse du cholestérol (Fig. 3 supplémentaire)29. La quantification du cholestérol ainsi que des intermédiaires desmostérol et zymostérol a révélé que les intermédiaires se trouvaient à des concentrations similaires ou supérieures au cholestérol (tableau supplémentaire 1). Enfin, pour contrôler la contamination potentielle, nous avons extrait à la fois le milieu de culture et l'E. coli supplémentaire concentré sans biomasse bactérienne. Le milieu et les contrôles d'extraction étaient dépourvus de stérols (Fig. 4 supplémentaire).

a Chromatogramme d'ions totaux de stérols libres d'E. salina extraits à l'aide de la procédure modifiée de Bligh Dyer. Les stérols identifiés comprenaient le cholestérol (VII) ainsi que les intermédiaires insaturés en C-24 (I-VI). b Chromatogramme ionique total des stérols liés à l'éther et à l'ester libérés des extraits lipidiques d'E. salina par hydrolyse acide. L'hydrolyse a libéré des stérols supplémentaires, dont le 25-hydroxycholestérol (VIII) et d'autres hydroxystérols putatifs (indiqués par un astérisque). Tous les lipides ont été dérivés en groupes triméthylsilyle. Les spectres de masse des stérols identifiés sont présentés dans la Fig. 1 supplémentaire. Les données sources sont fournies sous forme de fichier de données source.

Pour évaluer E. salina pour les conjugués de stérols potentiels, nous avons hydrolysé à la fois l'extrait lipidique total (TLE) et la biomasse cellulaire avec soit une base méthanolique, qui clive les lipides liés à l'ester, soit l'acide méthanolique, qui clive les lipides liés à l'ester et à l'éther30. L'hydrolyse de TLE avec une base méthanolique n'a pas libéré de stérols supplémentaires, mais l'hydrolyse avec de l'acide méthanolique a libéré du 25-hydroxycholestérol (25-OHC) ainsi que des oxystérols supplémentaires et d'autres composés de stérols modifiés potentiels (Fig. 1b et Fig. 5 supplémentaire). La présence d'oxystérols après hydrolyse acide du TLE, mais pas après hydrolyse basique, suggère que ces conjugaisons sont médiées par une liaison éther. Pour caractériser davantage la nature chimique des conjugués de stérols, nous avons séparé les lipides extractibles par polarité en utilisant la chromatographie sur colonne de Si-gel et les fractions hydrolysées avec de l'acide méthanolique. Après hydrolyse, tous les stérols, y compris les hydroxystérols, n'étaient présents que dans la fraction alcoolique, ce qui suggère que les stérols conjugués ont une polarité similaire aux stérols libres. L'hydrolyse directe de la biomasse cellulaire avec une base méthanolique ou un acide n'a pas modifié le profil de stérols d'E. salina par rapport à celui des TLE hydrolysés. Pour confirmer que ces stérols supplémentaires n'étaient pas des produits de dégradation ou d'auto-oxydation au cours de l'hydrolyse, nous avons d'abord hydrolysé à l'acide des étalons de cholestérol et de desmostérol et n'avons détecté aucune production d'hydroxystérols. Nous avons également ajouté de l'hydroxytoluène butylé (BHT) à une extraction par hydrolyse acide d'E. salina et avons toujours détecté le 25-hydroxycholestérol et les autres stérols modifiés potentiels observés dans les extractions sans BHT (Fig. 6 supplémentaire).

La production de cholestérol par E. salina nous a incités à rechercher une voie de biosynthèse putative dans son génome. Nous avons effectué une recherche BLASTp (<1 × e-30, 30% ID) contre les protéines de biosynthèse des stérols d'eucaryotes et de bactéries4,31. Nous avons choisi un seuil restrictif pour ces recherches BLASTp afin de mieux garantir que les protéines identifiées sont probablement impliquées dans la biosynthèse des stérols, car les protéines de la voie de biosynthèse du cholestérol appartiennent à de grandes superfamilles qui incluent des fonctions en dehors de la biosynthèse des stérols5. Nous avons détecté des homologues pour presque toutes les étapes de la voie de biosynthèse du cholestérol eucaryote dans le génome d'E. salina (Fig. 2 et Tableau supplémentaire 2), bien qu'une caractérisation biochimique plus poussée soit nécessaire pour démontrer que les protéines identifiées n'effectuent pas de réactions supplémentaires dans la cellule. Notamment, les gènes de biosynthèse des stérols ne sont pas localisés dans des grappes de gènes, comme observé chez d'autres bactéries productrices de stérols32, mais se trouvent plutôt dans des loci séparés à travers le génome (Fig. 7 supplémentaire). En utilisant cette voie de biosynthèse du cholestérol nouvellement construite, nous avons ensuite recherché des homologues dans d'autres bactéries ayant une capacité génomique démontrée pour la production de stérols (<1 × e-50, 30% ID). Nous avons identifié 103 isolats bactériens et 21 génomes assemblés par métagénome avec la squalène monooxygénase (SMO) et l'oxydosqualène cyclase (OSC), les premières étapes engagées dans la biosynthèse des stérols. Parmi ces OSC et SMO contenant des génomes et des métagénomes bactériens, seuls les autres isolats séquencés d'E. salina partagent les homologues requis pour la voie de biosynthèse du cholestérol eucaryote, indiquant que la production de cholestérol est probablement une caractéristique commune de ces espèces d'E. salina (Données supplémentaires 1) .

Les homologues des protéines eucaryotes canoniques pour la biosynthèse du cholestérol ont été identifiés par recherche BLASTp (<1 × e−30, 30% ID; Tableau supplémentaire 2). Les stérols identifiés dans la biomasse d'E. salina sont en gras. E. salina n'a pas d'homologues aux enzymes eucaryotes responsables de la déméthylation C-4 et de l'hydroxylation C-25. Les enzymes bactériennes pour la déméthylation complète du stérol C-4 et l'hydroxylation C-25 n'ont pas été identifiées et sont indiquées par un point d'interrogation. Le contexte génomique des gènes E. salina identifiés est illustré à la Fig. 7 supplémentaire. Les données sources sont fournies sous forme de fichier de données source.

Alors que E. salina partage une grande partie de sa voie de biosynthèse du cholestérol avec les eucaryotes, il n'a pas d'homologues aux trois protéines eucaryotes responsables de la déméthylation du C-4. Au lieu de cela, E. salina a des homologues de la paire dioxygénase-réductase, SdmAB, utilisée par les méthanotrophes aérobies pour éliminer un seul groupe méthyle en C-431. Pour tester si les homologues d'E. salina SdmAB sont suffisants pour éliminer les deux groupes méthyle en C-4, comme cela est nécessaire pour produire du cholestérol, nous avons utilisé un système d'expression hétérologue dans une souche d'E. coli conçue pour surproduire le substrat lanostérol (Fig. 3a )33. L'expression de l'homologue de SdmA seul a entraîné la production d'un intermédiaire 4-méthylaldéhyde. L'expression de l'homologue de SdmB seul n'a généré aucun intermédiaire de déméthylation (Figs. 8 et 9 supplémentaires). Fait intéressant, la co-expression des homologues de SdmAB n'a entraîné l'élimination d'aucun groupe méthyle en C-4 (Fig. 3b), ce qui indique que ces deux protéines ne sont pas suffisantes pour déméthyler complètement le lanostérol en position C-4 chez E. salina et distinguant SdmAB chez E. salina des homologues trouvés chez les méthanotrophes aérobies.

a Chromatogrammes d'ions totaux montrant la production de substrat de lanostérol (I) dans notre système d'expression hétérologue E. coli. b Co-expression d'homologues de SdmAB à partir d'E. salina, entraînant la production d'un seul intermédiaire 4-méthylaldéhyde (III). Ces deux enzymes sont insuffisantes pour déméthyler en C-4, ce qui les distingue des homologues de SdmAB chez les méthanotrophes aérobies. c Co-expression d'homologues de SdmAC d'E. salina, entraînant l'élimination d'un seul groupe méthyle en C-4. d Co-expression d'homologues SdmABC d'E. salina, entraînant une déméthylation complète en C-4. Les lipides ont été dérivés en groupes triméthylsilyle. Les intermédiaires de déméthylation C-4 ont été confirmés dans une étude précédente et identifiés ici par comparaison avec les spectres de masse publiés (32). Les spectres de masse des stérols identifiés sont présentés dans la Fig. 9 supplémentaire. Les données sources sont fournies sous forme de fichier de données source.

Nous avons ensuite cherché à déterminer si l'absence de déméthylation du C-4 par les homologues d'E. salina était liée à SdmA ou SdmB. Pour ce faire, nous avons exploité les homologues SdmA et SdmB de Methylococcus capsulatus - qui suppriment ensemble un seul groupe méthyle dans notre système d'expression - et les avons exprimés avec leur partenaire réciproque SdmA ou SdmB de E. salina. L'expression de SdmA d'E. salina avec SdmB de M. capsulatus a entraîné la suppression d'un seul groupe méthyle en C-4, tandis que l'expression de SdmB d'E. salina avec SdmA de M. capsulatus n'a entraîné aucune déméthylation en C-4 (supplémentaire figure 10). Ainsi, nous proposons que l'homologue E. salina SdmA puisse effectuer les réactions d'oxygénation nécessaires à la déméthylation, mais l'homologue E. salina SdmB est insuffisant pour effectuer à la fois les réactions de décarboxylation et de réduction nécessaires à la déméthylation en position C-4. Ces résultats nous ont amenés à réévaluer E. salina pour les enzymes ayant le potentiel de réaliser les réactions de décarboxylation et de réduction.

Grâce à une recherche BLASTp supplémentaire du génome d'E. salina, nous avons identifié une autre réductase de type SDR homologue à SdmB, SdmC (1 × e−120, 51% d'identité), limitée au sous-ordre Myxococcota Nannocystaceae (Fig. 11 supplémentaire). L'expression de SdmC seule n'a entraîné aucune accumulation d'intermédiaires de déméthylation (Fig. 8 supplémentaire). Cependant, la co-expression de SdmC avec SdmA de E. salina a entraîné la suppression d'un seul groupe méthyle en C-4, suggérant que SdmC est capable de décarboxyler le groupe méthyle oxydé et de réduire la cétone restante en C-3 en un hydroxyle comme c'était le cas. montré pour le M. capsulatus SdmB (Fig. 3c)31. De plus, la co-expression de SdmC avec E. salina SdmAB entraîne l'élimination des deux groupes méthyle en C-4 et la production d'intermédiaires de déméthylation supplémentaires (Fig. 3d). Ainsi, la déméthylation complète en position C-4 chez E. salina est distincte de la déméthylation bactérienne en C-4 chez les méthanotrophes aérobies et les eucaryotes (Fig. 12 supplémentaire).

Alors que SdmC semble limité à un sous-ordre myxobactérien spécifique, des homologues de SdmAB peuvent être trouvés dans une variété de génomes acquis d'isolats et de métagénomes (MAG) dans tout le domaine. Cela comprend 31 bactéries réparties sur cinq embranchements différents (Données supplémentaires 1). Nous souhaitions déterminer si ces autres homologues de SdmAB étaient également suffisants pour déméthyler le lanostérol deux fois ou s'ils fonctionnaient de manière plus similaire aux homologues de SdmAB chez les méthanotrophes aérobies, et ne supprimaient qu'un seul groupe méthyle en C-4. En particulier, la cyanobactérie Calothrix sp. Le génome NIES-4105 abrite des homologues de SdmAB dans un groupe de gènes de 21 kb, qui contient également des homologues pour la production d'oxydosqualène, la cyclisation, la déméthylation de C-14, l'isomérisation de C-8 et plusieurs protéines supplémentaires probablement impliquées dans la biosynthèse des stérols (Fig. 4a et tableau supplémentaire 2 ). Cette diversité de gènes de biosynthèse de stérols dans une cyanobactérie n'a pas été observée auparavant, ce qui suggère que cette souche de Calothrix pourrait produire des stérols complexes entièrement déméthylés en position C-4. Pour tester cela, nous avons d'abord exprimé de manière hétérologue l'homologue de Calothrix osc dans une souche d'E. coli produisant de l'oxydosqualène, entraînant la production de lanostérol et confirmant que la cyclase de Calothrix est fonctionnelle (Fig. 13 supplémentaire). Nous avons ensuite exprimé les homologues de Calothrix SdmAB pour déterminer si ces protéines étaient capables de déméthylation en C-4. L'expression de l'homologue de SdmA seul a entraîné la production d'un intermédiaire 4-méthylaldéhyde tandis que l'expression de l'homologue de SdmB seul a entraîné la production de lanostérone (Figs. 8 et 9 supplémentaires). La co-expression de Calothrix SdmAB était suffisante pour éliminer les deux groupes méthyle en C-4, démontrant une troisième voie de déméthylation bactérienne en C-4, distincte de E. salina, des méthanotrophes aérobies et des eucaryotes (Fig. 4b et Fig. 12 supplémentaire).

a Les gènes de biosynthèse des stérols dans Calothrix sont localisés dans un seul groupe de gènes. Les gènes identifiés par notre recherche BLAST sont indiqués en rouge et les étiquettes de texte en gras. Il convient de noter plusieurs autres gènes annotés en tant que gènes de biosynthèse putatifs qui peuvent être responsables de la réalisation d'étapes supplémentaires dans la biosynthèse du cholestérol. b Chromatogrammes ioniques totaux de la production de substrat de lanostérol dans notre système d'expression hétérologue et coexpression d'homologues SdmAB de Calothrix entraînant une déméthylation complète en C-4. Les lipides ont été dérivés en groupes triméthylsilyle. Les intermédiaires de déméthylation C-4 ont été confirmés dans une étude précédente et identifiés ici par comparaison avec les spectres de masse publiés (32). Les spectres de masse des stérols identifiés sont présentés dans la Fig. 9 supplémentaire. Les données sources sont fournies sous forme de fichier de données source.

Compte tenu des preuves génétiques et biochimiques de la production complexe de stérols chez Calothrix, nous avons ensuite analysé les stérols produits par cette bactérie. Dans notre analyse initiale, nous n'avons pu détecter les stérols qu'après l'hydrolyse acide de la biomasse cellulaire (Figs. 1, 2 et 13 supplémentaires). Ces stérols comprenaient du cholestérol ainsi que des intermédiaires insaturés en C-24 et saturés en C-24. Nous avons également identifié du 25-OHC dans des extraits hydrolysés de Calothrix, ce qui suggère en outre que des stérols peuvent être conjugués dans Calothrix. Cependant, tout au long des analyses lipidiques, Calothrix a cessé toute production de stérols. Pour déterminer si la perte de production de stérols chez Calothrix était due à une mutation génétique dans le groupe de gènes biosynthétiques des stérols, nous avons séquencé le génome de la souche passée en série et l'avons comparé au génome de référence de Calothrix sp. NIES-4105. Nous avons détecté 14 mutations dans le génome de la souche de passage en série par rapport au génome de référence disponible dans les bases de données JGI IMG et NCBI, cependant, aucune de ces mutations ne s'est produite dans ou en amont du groupe de gènes de biosynthèse des stérols (tableau supplémentaire 3). Bien que ces résultats rendent notre analyse initiale des stérols de Calothrix peu concluante, nos découvertes suggèrent que les cyanobactéries sont une source potentielle de stérols biosynthétiquement complexes et un phylum à prendre en compte lors de l'étude de la biosynthèse des stérols bactériens.

Dans cette étude, nous démontrons que les bactéries abritent la capacité de synthétiser le cholestérol de novo, affichant une complexité biosynthétique souvent associée aux eucaryotes et suggérant la possibilité de fonctions physiologiques nuancées pour les stérols chez les bactéries. Notre analyse d'E. salina a identifié le cholestérol ainsi que des intermédiaires dans la voie de biosynthèse du cholestérol. La quantification de ces lipides montre que les intermédiaires biosynthétiques se produisent à des concentrations supérieures ou similaires au cholestérol lui-même. Ceci est distinct de la production de cholestérol chez de nombreux eucaryotes, où des intermédiaires peuvent être présents, mais souvent à des concentrations d'ordres de grandeur inférieurs au cholestérol ou à d'autres stérols « produits finaux »34,35. Compte tenu des concentrations élevées de ces intermédiaires dans cette bactérie par rapport au cholestérol, nous postulons que les intermédiaires du cholestérol, tels que le desmostérol et le zymostérol, servent eux-mêmes de lipides fonctionnels, bien que ces fonctions et si elles diffèrent du cholestérol, restent floues.

Nos analyses de Calothrix ont fourni des preuves génomiques et biochimiques d'une capacité de production de stérols complexes, cependant, la production de stérols par cette bactérie reste incertaine. Historiquement, la biosynthèse de novo des stérols dans les cyanobactéries a été controversée. L'analyse précoce des stérols des cyanobactéries a suggéré une capacité de biosynthèse complexe des stérols36. Cependant, il y avait un manque de preuves génomiques à l'appui et, dans plusieurs cas, il a été démontré plus tard que la production de stérols était causée par une contamination fongique37,38. Nos travaux démontrant la fonctionnalité des protéines de biosynthèse des stérols de Calothrix, combinés à des données bioinformatiques montrant une capacité génétique similaire chez d'autres cyanobactéries, encouragent les recherches futures sur les enzymes biosynthétiques présentes dans ces bactéries et une analyse plus approfondie des stérols qu'elles produisent. De plus, nous avons identifié les gènes nécessaires à la biosynthèse complexe des stérols, y compris la déméthylation des C-14 et C-4, dans un ensemble diversifié de bactéries, y compris d'autres myxobactéries et cyanobactéries, ainsi que des actinobactéries, des acidobactéries et des nitrospirées (Données supplémentaires 1). Dans bon nombre de ces bactéries, la production de stérols n'a pas encore été analysée. Le couplage d'une analyse plus robuste des lipides avec une étude plus approfondie de la biosynthèse des stérols bactériens nous permettrait de mieux comprendre la distribution, la diversité et la complexité des stérols chez les bactéries.

La présence de stérols libres et conjugués dans E. salina fournit un autre exemple de la complexité biosynthétique de la production de stérols bactériens. La conjugaison des stérols bactériens n'est pas limitée à E. salina ; d'autres bactéries conjuguent des stérols, soit en tant que produit de la biosynthèse de novo21, soit en tant que modification de stérols acquis de manière exogène39,40. Ces différents pools de stérols suggèrent le potentiel d'un ensemble varié de rôles physiologiques pour les stérols dans les bactéries. Les conjugaisons à d'autres macromolécules ont un impact sur les propriétés biophysiques des stérols41 et, dans les systèmes eucaryotes, ces lipides modifiés sont impliqués dans des fonctions spécifiques, notamment le stockage des lipides et la défense cellulaire16,17. Alors que des conjugués de stérols intacts n'ont pas été identifiés dans les bactéries productrices de stérols, les conjugués de stérols identifiés chez les eucaryotes et les bactéries capables de modifier les stérols exogènes peuvent donner un aperçu des types de molécules qui pourraient être présentes dans ces bactéries productrices de stérols. Cela comprend les glucosides de stéryle, qui ont été identifiés à la fois chez les eucaryotes35 et les bactéries modifiant les stérols39, et les esters de stérols, qui, à notre connaissance, n'ont été trouvés que chez les eucaryotes16,42,43. L'élargissement des techniques d'extraction utilisées pour analyser les lipides de stérols, l'identification des conjugués de stérols présents et l'exploration des enzymes responsables des modifications en aval permettraient une meilleure évaluation de la diversité des stérols conjugués dans le domaine bactérien tout en fournissant une base pour une exploration plus approfondie de la fonction des stérols.

La production de cholestérol par les bactéries indique également une histoire évolutive compliquée pour la biosynthèse des stérols dans le domaine bactérien. La biosynthèse complexe des stérols est un processus ancien ; On pense que l'oxydosqualène cyclase (OSC), responsable de la cyclisation des stérols, a évolué autour du grand événement d'oxydation32 et que les gènes de biosynthèse des stérols eucaryotes modernes sont probablement antérieurs au dernier ancêtre commun eucaryote5. La biosynthèse des stérols dans les bactéries a été théorisée comme étant le produit d'un transfert horizontal de gènes à partir d'eucaryotes, soutenu par sa rareté et sa distribution inégale à travers les phylums bactériens32. Cependant, des analyses phylogénétiques et structurales récentes de l'OSC et de la C-14 déméthylase (CYP51) suggèrent une origine bactérienne pour ces protéines25,26,44. La voie putative de biosynthèse du cholestérol E. salina que nous avons identifiée est largement homologue à la voie eucaryote, indiquant une histoire évolutive partagée pour une grande partie de la biosynthèse du cholestérol entre cette myxobactérie et les eucaryotes, bien que notre analyse ne fournisse pas d'informations sur la directionnalité de l'acquisition. Cependant, nous avons identifié plusieurs protéines de biosynthèse du cholestérol impliquées dans la modification de la désaturation, et ces protéines n'ont pas été prises en compte dans les analyses phylogénétiques (Données supplémentaires 1). D'autres analyses biochimiques et phylogénétiques de ces protéines en aval pourraient mieux résoudre les relations évolutives régissant la production de stérols dans ces deux domaines.

La déméthylation bactérienne en C-4 continue de fournir un exemple distinct d'évolution indépendante de la biosynthèse des stérols. Nous avons identifié des protéines responsables de la déméthylation complète du C-4 chez E. salina et Calothrix distinctes de celles des eucaryotes, des méthanotrophes aérobies et entre elles. Chez les eucaryotes, la déméthylation du C-4 est une réaction dépendante de l'oxygène effectuée par trois protéines - une stérol méthyl oxydase C-4 (ERG25/SMO), une décarboxylase C-4 (ERG26/3β-HSD/D) et un 3-cétostéroïde réductase (ERG27/3-SR)45,46,47. Les trois protéines sont impliquées dans un processus itératif qui élimine séquentiellement les deux groupes méthyle en position C-4, bien qu'il ait été démontré que les plantes utilisent deux protéines SMO distinctes pour éliminer chaque groupe méthyle de manière non séquentielle48. Nous avons précédemment montré que chez les méthanotrophes aérobies, la déméthylation du C-4 entraîne la suppression d'un groupe méthyle et est réalisée par une oxygénase de type Rieske, SdmA, et une réductase NADP-dépendante, SdmB31. Bien que E. salina et Calothrix abritaient des homologues de SdmA et SdmB, il n'était pas clair si ces deux protéines seraient suffisantes pour éliminer les deux groupes méthyle en position C-4. Nous montrons que les deux homologues de Calothrix sont en effet suffisants pour éliminer les deux groupes méthyle en C-4, mais E. salina nécessite une deuxième réductase pour se déméthyler complètement. Ces enzymes ne sont pas homologues aux protéines eucaryotes canoniques et établissent que la biosynthèse du cholestérol chez ces bactéries n'est pas un simple cas de transfert horizontal de gènes. Il représente plutôt un cas d'évolution convergente dans la biologie des stérols qui implique un rôle critique de la déméthylation des stérols C-4 dans la fonction des stérols dans les deux domaines de la vie. En effet, il a été démontré que la déméthylation de C-4 est nécessaire au bon fonctionnement des eucaryotes, car les mutations de la déméthylase de C-4 sont souvent mortelles45,49,50. Ce qui reste incertain, c'est le rôle fonctionnel que joue la déméthylation du C-4 dans les cellules bactériennes et s'il est nécessaire au bon fonctionnement des stérols, comme observé chez les eucaryotes. Une caractérisation biochimique et structurelle plus poussée des différentes voies de déméthylation bactérienne du C-4 devrait fournir des informations comparatives sur l'importance fonctionnelle de cette modification.

Enfin, la biosynthèse complexe des stérols chez les bactéries présente également un intérêt pour ses potentielles applications industrielles et biomédicales. La production de lipides triterpénoïdes cycliques, y compris les hopanoïdes chez les bactéries et les stérols chez les champignons, a été suggérée pour augmenter la résilience de ces microbes aux différents stress rencontrés dans les conditions de culture industrielle, y compris le stress lié à la température et à l'éthanol51,52. Une meilleure compréhension des gènes de biosynthèse des stérols et le développement de systèmes d'expression des stérols offrent d'autres opportunités pour mieux concevoir des microbes pour des applications industrielles. De plus, plusieurs myxobactéries, y compris d'autres isolats d'E. salina, produisent des métabolites secondaires dérivés de stéroïdes avec des propriétés antimicrobiennes démontrées53,54,55. Cependant, les myxobactéries, en particulier celles des milieux marins comme E. salina, sont souvent difficiles à cultiver, génétiquement intraitables et produisent des métabolites secondaires à de faibles concentrations56. Cela a conduit à un intérêt accru pour la compréhension des voies de biosynthèse des produits naturels dans ces organismes et pour le développement de systèmes hétérologues pour produire ces composés57. L'exploration de la biosynthèse des stéroïdes dans les myxobactéries peut en outre révéler de nouvelles enzymes de biosynthèse tout en fournissant un cadre pour mieux produire ces composés. En outre, le système d'expression hétérologue modulaire que nous utilisons ici pour explorer la déméthylation de C-4 présente une opportunité de surproduire des intermédiaires biosynthétiques dans la biosynthèse du cholestérol, dont beaucoup sont autrement indisponibles dans le commerce ou d'un coût prohibitif. Ces intermédiaires biosynthétiques se sont avérés utiles pour étudier la biosynthèse, la régulation et la fonction du cholestérol chez les eucaryotes et, dans certains cas, ont des implications cliniques58. Continuer à caractériser la biosynthèse bactérienne du cholestérol à l'aide de ces systèmes hétérologues permettra de développer des outils pour mieux étudier les stérols dans d'autres organismes, tout en fournissant un aperçu de questions plus larges concernant la biologie et l'évolution des stérols.

Les souches utilisées dans cette étude sont répertoriées dans l'annexe SI, tableau S4. E. salina DSM 15201 a été cultivée dans 20 ml de milieu de sels d'eau de mer (SWS), pH 7 dans des flacons Erlenmeyer, complété avec des cellules entières autoclavées et concentrées E. coli, à 30 ° C avec agitation à 225 tr/min (Thermo Scientific, MaxQ8000 ), pendant 14 jours27. Pour préparer la cellule entière concentrée d'E. coli, E. coli DH10B a été cultivé jusqu'à OD600 entre 1,0 et 1,5 dans 500 ml de milieu LB dans un flacon Erlenmeyer. Cet E. coli a été culotté, remis en suspension dans 50 ml de SWS et autoclavé. Au cours de 14 jours, 5 ml de cette suspension concentrée d'E. coli ont été introduits dans la culture d'E. salina au fur et à mesure que le milieu se clarifiait59. Calothrix sp. NEIS-4105 a été cultivé dans 20 ml de milieu liquide BG-11, pH 760 dans un flacon Erlenmeyer à 25 ° C pendant 60 jours avec des cycles de lumière de 10 h et d'obscurité de 14 h. Les souches d'expression hétérologues d'E. carbénicilline (100 μg/mL) et/ou chloramphénicol (20 μg/mL).

Les stérols non liés ont été extraits des culots cellulaires lyophilisés par une extraction Bligh-Dyer modifiée28. Les pastilles ont été soniquées pendant 1 h dans 10:5:4 (vol:vol:vol) méthanol : dichlorométhane (DCM) : eau. Les lipides ont ensuite été séparés en phase en utilisant deux fois le volume 1:1 (vol:vol) DCM:eau. La phase organique a été transférée et évaporée sous gaz N2 donnant des extraits lipidiques totaux (TLE). Le cas échéant, le TLE a été fractionné par polarité en utilisant la chromatographie Si selon le schéma de colonne suivant : 1,5 volumes de colonne d'hexanes, 2 volumes de colonne d'hexane 8:2 (vol : vol) : DCM, 2 volumes de colonne de DCM, 2 volumes de colonne 1 : 1 (vol: vol) DCM : acétate d'éthyle, 2 volumes de colonne d'acétate d'éthyle donnant respectivement une fraction alcynes, non polaire, cétone, alcool et polaire61.

Les stérols liés ont été analysés en hydrolysant des extraits lipidiques, des fractions de chromatographie sur gel de Si ou des culots cellulaires lyophilisés dans HCl 1 N ou KOH dans du méthanol et chauffés à 75 ° C pendant 3 h. Les réactions ont été neutralisées en utilisant respectivement KOH ou HCl et les phases ont été séparées en utilisant deux fois le volume de 1:1 (vol:vol) DCM:eau. La phase organique a été transférée et évaporée sous gaz N2. Le cas échéant, de l'hydroxytoluène butylé (BHT) a été ajouté aux échantillons d'hydrolyse acide à une concentration finale de 0,01 % (poids : volume) de BHT : MeOH62.

Les concentrations de cholestérol, de desmostérol, de zymostérol et de 25-hydroxycholestérol (25OCH) dans les échantillons ont été quantifiées à l'aide d'une courbe standard allant de 10 ng à 100 ng. La teneur en stérols a été calculée à l'aide de la courbe standard et normalisée au poids des cellules séchées de chaque échantillon. De plus, la limite de détection des stérols sur notre spectromètre de masse a été déterminée entre 1 et 5 ng en diluant un mélange standard de stérols.

Tous les lipides ont été dérivés en éthers triméthylsilyliques en utilisant 1: 1 (vol: vol) bis (triméthylsilyl) trifluoroacétamide: pyridine et chauffage à 70 ° C pendant 1 h avant analyse sur un GC Agilent série 7890B. Les lipides ont été séparés sur une colonne Agilent DB17HT de 60 m (60 mx 0,25 mm id x 0,1 μm d'épaisseur de film) avec de l'hélium comme gaz porteur à un débit constant de 1,1 mL/min et programmé comme suit : 100 °C pendant 2 min ; puis 8 °C/min à 250 °C et maintenu pendant 10 min ; puis 3 °C/min à 330 oC et maintenu pendant 17 min. Au total, 2 μL de chaque échantillon ont été injectés en mode splitless à 250 °C. Le GC a été couplé à un MSD série 5977 A avec la source d'ions à 230 ° C et fonctionnait à 70 eV en mode EI balayant de 50 à 850 Da en 0, 5 s. Les lipides ont été analysés à l'aide de l'analyse qualitative Agilent MassHunter (B.06.00) et identifiés sur la base du temps de rétention et des spectres par comparaison avec des normes de laboratoire précédemment confirmées, des spectres publiés31,63,64 et des spectres déposés auprès de l'American Oil Chemists' Society (AOCS). Library (http://lipidlibrary.aocs.org/index.cfm) ou les bases de données du National Institute of Standards and Technology (NIST).

Les plasmides et les oligonucléotides utilisés dans cette étude sont décrits dans le tableau supplémentaire 5 et le tableau supplémentaire 6. Les oligonucléotides ont été achetés auprès d'Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). L'ADN génomique d'E. salina a été isolé à l'aide du kit de purification d'ADN génomique GeneJET (Thermo Scientific). ADN génomique de Calothrix sp. NEIS-4105 a été isolé à l'aide d'une extraction au phénol-chloroforme65, où un volume de 25:24:1 phénol : chloroforme : alcool isoamylique (vol : vol : vol) a été ajouté à la biomasse, centrifugé et la couche aqueuse retirée. Ceci a été répété deux fois avant de précipiter l'ADN génomique en utilisant deux fois le volume d'éthanol à 70 %. L'ADN plasmidique a été isolé à l'aide du kit GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo Scientific). Les fragments d'ADN utilisés lors du clonage ont été isolés à l'aide du kit d'extraction de gel GeneJET (Thermo Scientific). L'ADN a été séquencé par ELIM Biopharm (Hayward, CA).

Les plasmides ont été construits par clonage indépendant de la séquence et de la ligature (SLIC)66. En bref, des surplombs complémentaires ont été créés sur des inserts de produit de PCR purifiés sur gel et un vecteur linéarisé par une enzyme de restriction par incubation avec l'ADN polymérase T4 (EMD Milipore) en l'absence de nucléotides. Cela a été suivi d'une réaction d'hybridation et d'une transformation sans ligature. Les souches d'E. coli ont été transformées par électroporation à l'aide d'un électroporateur MicroPulser (BioRad) tel que recommandé par le fabricant.

Les gènes de biosynthèse des stérols ont été surexprimés dans E. coli à partir de plasmides compatibles avec un promoteur lac inductible par l'IPTG ou araBAD inductible par l'arabinose33. Des souches d'expression hétérologues ont été construites comme décrit dans le tableau supplémentaire 7. Les gènes d'intérêt ont été exprimés à partir du plasmide pSRKGm-lacUV5-rbs5 inductible par l'IPTG et/ou du plasmide pBAD1031K inductible par l'arabinose. Les souches d'E. coli ont été cultivées à 37 ° C, dans 20 ml de milieu TYGPN additionné d'antibiotiques (si nécessaire) jusqu'à la phase mi-exponentielle lorsque l'expression a été induite avec 500 μM d'IPTG et 0, 2% (wt: vol) arabinose pendant 30 à 40 h à 30 ° C avec agitation à 225 tr/min, avant la récolte des cellules.

Pour identifier les gènes de biosynthèse des stérols chez E. salina et Calothrix, nous avons effectué une recherche BLASTp67. Pour être considéré comme un gène putatif de la biosynthèse des stérols, nous avons fixé un seuil de valeur e de 1 xe−30 et un seuil d'identité en pourcentage de 30. Les résultats de la recherche BLASTp sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 2. Pour identifier d'autres bactéries qui abritaient les gènes de la biosynthèse des stérols nous avons identifié chez E. salina et Calothrix, nous avons d'abord effectué une recherche BLASTp des bactéries dans les bases de données génomiques sur le portail JGI IMG (https://img.jgi.doe.gov/) pour OSC (<1 × e −50, 30 % ID). Dans ce sous-ensemble de bactéries, nous avons effectué d'autres recherches BLASTp (<1 × e-50, 30 % ID) en utilisant des protéines identifiées d'E. salina et de Calothrix68,69. Un arbre voisin d'homologues de SdmBC a été généré en alignant les séquences de protéines à l'aide de MUSCLE dans MEGA (11.0.10). L'arbre phylogénétique a ensuite été généré à l'aide du modèle gamma, de quatre catégories de taux gamma et de 500 répliques bootstrap.

La préparation de la bibliothèque (Illumina DNA Prep Kit; San Diego, CA) et le séquençage du génome entier ont été effectués par SeqCenter (SeqCenter; Pittsburgh, PA) et séquencés sur un Illumina NextSeq 2000, produisant des lectures de 2x151 pb. Bclconvert (v3.9.3) a été utilisé pour le démultiplexage, le contrôle qualité et le découpage. Pour identifier les mutations dans la souche de passages en série, l'appel de variant a été effectué à l'aide de breseq (v0.35.4)70.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données générées dans cette étude sont fournies dans les fichiers d'informations supplémentaires et de données sources. Les identifiants de gènes JGI IMG (https://img.jgi.doe.gov/) pour les gènes de biosynthèse des stérols chez E. salina et Calothrix sont fournis dans le tableau supplémentaire 2. Le fichier de données source comprend les données brutes du chromatogramme d'ions totaux utilisées pour générer texte principal et figures supplémentaires, ainsi que les données brutes de spectrométrie de masse utilisées pour générer des données de spectres supplémentaires. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions les membres du laboratoire Welander pour des discussions utiles. Le financement de cette étude a été fourni par le National Science Foundation Award 1919153 (à PVW).

Département des sciences du système terrestre, Université de Stanford, Stanford, CA, 94305, États-Unis

Alysha K. Lee, Jeremy H. Wei et Paula V. Welander

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Recherche conçue par AKL, JHW ​​et PVW ; AKL et JHW ont effectué des recherches; AKL, JHW ​​et PVW ont analysé les données ; et AKL, JHW ​​et PVW ont rédigé l'article.

Correspondance à Paula V. Welander.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Miguel C. Santoscoy et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Lee, AK, Wei, JH & Welander, PV Biosynthèse de novo du cholestérol chez les bactéries. Nat Commun 14, 2904 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38638-8

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Reçu : 20 octobre 2022

Accepté : 05 mai 2023

Publié: 22 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-38638-8

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